点击显示 收起
冰片作为一种常用中药，近十年来，对其药性、药理等方面的研究已有很多的报道，但其在体内各组织的吸收、分布及排泄的研究则较少报道，上海中医学院同位素室用同位素标记的方法用小鼠做过这方面的研究 ［1］ ，而本文尝试用现代分析仪器GC/MS对给药大鼠各脏器的冰片含量进行测定，并初步建立了测定方法，为进一步了解冰片在体内的代谢、转归提供一种研究手段。
1 材料和方法
1.1 试药与试剂 冰片，中国药品生物制品检定所（化学对照品，批号:743-8701）;萘，中国药品生物制品检定所（化学对照品）;正己烷，德国Riedel-deHaen，色谱纯，批号:4152A;冰片，广州市药材公司购入。
1.2 仪器及色谱条件 GC/MS-QP2010型气相色谱-质谱仪，Labsolutions数据处理系统，日本岛津公司;DB-5MS弹性毛细管色谱柱，规格30M膜厚，SerialNo.us332546H美国;气化室温度220℃;接口温度250℃;EI源温度200℃/70eV;炉温度120℃;载气He，流速1ml/min;分流比5:1;倍增电压1100V;选择离子检测（SIM），冰片M/Z:95，萘M/Z:128。
1.3 给药方法和采血时间 SD健康大鼠（雌雄各半），体重200±10g，广东省医学实验动物中心提供;灌服280mg/kg体重（2.8%冰片/粟米油=g/v）后30min，45min，60min眼窝取血后，断头处死，取各脏器，生理盐水清洗，滤纸吸干，放置-40℃冰箱保存。
1.4 肝脏中冰片的提取 从-40℃冰箱中取出待测肝脏，待其解冻恢复常温后，精密称取100mg，于匀浆器中加入0.5ml生理盐水匀浆，转收入10ml试管，0.2ml2次及0.1ml1次冲洗匀浆器，并入10ml试管中，加入11.2μg/ml的萘（内标）正己烷溶液10μl，旋转混合30秒，加入提取溶剂正己烷1.5ml于水平振荡器中低档振摇20min，3000r/min离心5min，取上清液1μl进样测定。
2 结果
2.1 冰片在GC/MS条件下的离子流图 经扫描后谱库检索，与标准图谱比较，确认峰1，T R =3.983min为樟脑，峰2，TSR=4.220min为异龙脑，峰3，TSR=4.345min为龙脑，峰4，TSR=4.660min为内标萘，选择龙脑峰作为冰片的含量测定，以质荷比为95，128作为冰片及萘的检测离子，图1～4。
图1 空白肝匀浆离子流图（略）
图2 冰片对照品离子流图（略）
峰1:樟脑峰2:异龙脑峰3:龙脑峰4:内标萘
图3 空白肝匀浆加冰片标准品离子流图（略）
峰1:樟脑峰2:异龙脑峰3:龙脑峰4:内标萘
图4 含药肝匀浆离子流图（略）
2.2 方法考察
2.2.1 线性关系 精确称取冰片、萘（内标）适量，用正己烷配制成1.27mg/ml冰片储备液和1.40mg/ml萘储备液，于-4℃冰箱保存，实验时取出，用正己烷稀释成2.032μg/ml和11.2μg/ml的工作液。于1ml肝匀浆中加入10μl内标工作液和相应的冰片工作液，使冰片的含量分别为10.16、20.32、50.08、101.6、254.0、508.0ng，余下步骤与样品的处理方法相同。GC/MS分析。用所得龙脑峰面积与内标峰面积之比（A/Ai）和含量作回归分析，得回归方程F（x）=0.044742X-0.017486，r=0.9998，表明冰片（龙脑）在10.16～508.00ng线性关系良好。
2.2.2 精密度 取1ml空白肝匀浆（100mg肝/ml生理盐水），加入冰片工作液，制成高、中、低3个含量的样品，每个浓度做5个平衡样，按线性关系项下方法处理，测定三批样品，得批内和批间精密度。表1、2。
表1 批内精密度（略）
表2 批间精密度（略）
2.3 测定方法的回收率和最低检测量
2.3.1 提取方法回收率 取1ml空白肝匀浆（100mg肝/ml生理盐水），分别加入冰片工作液，配成含冰片20.32、203.20、457.20ng的样品，按线性关系项下操作，求算龙脑的峰面积A，另配相同的3个浓度的标准品溶液，不加入空白肝匀浆，按同法操作，求算龙脑峰面积B，以A/B100%计算提 取回收率，分析5个相同浓度样品。见表3。
表3 方法提取回收率（略）
2.3.2 最低检测量 用标准工作液配成含量在标准曲线低点浓度以下10.16、5.08、1.27、0.508、0.254、0.127ng的浓度，按标准曲线项下操作，以信噪比大于3为限，测得GC/MS的最低检测限为5.08ng。
2.4 测定方法的质量控制 配制3个浓度的样品20.32、203.20、457.20ng，与样品同时处理后一同进样测定，每浓度5个平衡样品。结果见表4。RSD小于2.87%，测得结果可靠。
表4 测定方法的质量控制（略）
3 讨论
冰片在临床治疗上已得到广泛应用，特别是在心脑血管成药中应用十分普遍，冰片的药性、药理亦有很多的研究报道，比如在动物体内（血液、大脑）中的动力学研究 ［2］ ，作为“引药”的机制研究 ［3］ 等，但是，冰片在动物体内各组织的吸收、分布以及排泄的研究却较少报道，而了解冰片在体内各组织的吸收及转运过程，对临床用药又有非常重要的指导意义。本文以现今广范使用的GC/MS分析方法为基础，建立了对大鼠各组织的冰片含量进行测定，其灵敏度、准确性、选择性以及可靠性均较为理想，而且操作简便，易于控制。用本方法对大鼠其它的脏器如心、脾、肺、肾等的冰片含量测定亦得到较为满意的结果，给药后60min，其含量从大到小依次为脾、肾、肝、心、肺。
对给药后大鼠的肝脏冰片的含量测定中，发现同一组的10只大鼠中有一半的龙脑峰（3号峰）含量远低于樟脑峰（1号峰）而另一半正好相反，它们之间的关系表现为此消彼长，此长彼消。这是否与给药浓度有关?还是与冰片的不稳定性有关?有待进一步的实验证实。合成冰片不稳定，其龙脑成分易转化为樟脑 ［4］ ，《中国药典》2000版冰片含量测定项下规定含龙脑不得少于55%，因此在实验前要注意冰片中此三种成分的比例，最好先测定其中各成分的含量，再进行实验。
【参考文献】
1 上海中医学院基础部同位素室.中成药研究，1981，5:8-12.
2 宋洪涛，郭涛.毛细管气相色谱法测定人体血浆中冰片的血药浓度.解放军药学学报，2003，19（1）:12-15.
3 王宁生，梁美容.冰片“佐使则有功”之实验研究.中医杂志，1994，35（1）:46-47.
4 魏刚，林双峰.GC-MS法检测冰片的质量.中成药，2005，27（3）:353-354.
作者单位:510405广东广州，广州中医药大学临床药理研究所
（编辑:黄 杰）