点击显示 收起
【摘要】 目的 研究柿叶的抗氧化和抗缺氧药理作用。 方法与结果 用NG108-15神经细胞培养过氧化氢（H 2 O 2 ）氧化应激和小鼠缺氧模型研究柿叶水提物的抗氧化和抗缺氧药理作用，发现5～100μg/ml柿叶水提物能明显提高H 2 O 2 引起的氧化应激损伤的培养NG108-15神经细胞活力，缓解氧化应激引起的神经细胞内GSH-Px和GSH的减少、MDA的增加以及LDH的漏出。灌胃给予50～300mg/kg柿叶水提物能明显延长小鼠常压缺氧存活时间;延长小鼠亚硝酸钠中毒缺氧存活时间和小鼠急性脑缺血性缺氧的喘气时间。 结论 柿叶水提物有明显的抗氧化和提高缺氧耐受力功能。
【关键词】 柿叶;抗氧化;耐缺氧;药理作用
Protection of extract of leaves of diospyros kaki against oxidative stress and hy-poxia
HUANG Ping，WU Qing-he，KONG Xiang-hua.
Department of Pharmacology，Guangzhou TCM University，Guangzhou510405，China
【Abstract】 Objective To evaluate the protection of water extract of leaves of Diospyros kaki（WELDK）against oxidative stress in vitro and against hypoxia in vivo.Methods NG108-15cell culture was exposed to300μM hydro-gen peroxide（H 2 O 2 ）pretreated with/without WELDK.The cell viability was assayed by MTT method.Glutathione（GSH），glutathione peroxidase（GSH-Px），malondialdehyde（MDA）and lactate dehydrogenase（LDH）in the cul-tured cells were assayed using corresponding assay kits.Mice survive time were tested under hypoxia with or without NaNO 2 toxication.Results Pretreating with5～100μg/ml of WELDK was found to raise the cell viability，to attenu-ate the reduction of GSH and GSH-Px，and to reduce the accumulation of MDA and the leak of LDH in NG108-15cells exposed to H 2 O 2 .50～300mg/kg of WELDK（by p.o.）was found to significant prolong the survival time of mice under hypoxia or toxication of NaNO 2 ，to prolong the breath time of decapitated mice.Conclusion It was sug-gested that WELDK had the protection against oxidative injury and against hypoxia.
【Key words】 leaves of Diospyros kaki（LDK）;antioxidant;protection against hypoxia;pharmacologic action
氧化应激和缺氧是衰老过程中的二种常见的病理因素，也是心脑血管疾病的两个普遍病理机制，二者常常相互作用而致病。人体衰老过程或长期动脉硬化、血管狭窄引起心脑等机体组织缺血缺氧、引起代谢障碍而又导致超氧阴离子等自由基大量爆发性产生，可导致身体组织，特别是对缺氧敏感的心脑组织的明显氧化应激损伤，最终引发心脑血管的病变，损害人体健康 ［1，2］ 。人们日益重视研发具有抗氧化和抗缺氧功能的医药保健产品，以达到抗衰老防病保健的效果。
柿叶是我国南北各地普遍栽培的食用品种柿树科植物柿Diospyros kaki Thunb.的新鲜或干燥叶 ［3，4］ 。柿叶资源丰富，具有多种医药保健功能，柿叶作为药用始载于明·《滇南本草》，以后诸家本草及医药书也多有记载 ［3］ 。柿叶味苦、性寒;具有下气平喘、止渴生津、疗疮、活血化瘀、凉血止血等功效 ［3，4］ 。国内外研究表明，以柿叶为原料制备的柿叶茶具有降血压、降血脂、降低胆固醇、抗氧化等多方面的药理功能 ［3～9］ ;用于防治心脑血管疾病，特别是动脉硬化症、高血压等，效果良好 ［3～8］ 。柿叶的医药保健用途正日益受到人们的重视。
本文研究柿叶水提物的抗缺氧和抗氧化功能，为开发柿叶抗衰老医药保健用途提供实验依据。
1 实验材料
1.1 药品 柿叶水提取物浸膏（以下简称柿叶水提物）:柿叶加水煎煮二次，第一次加15倍量水沸煮1.5h，第二次加12倍量水沸煮1h，合并煎液，滤过;滤液减压浓缩至相对密度为1.28（80℃热测定）的稠膏;80℃以下减压干燥，每1g相当于柿叶15.0g。芦丁（中国国家药品生物制品检定所购进）;精密称取药物，用蒸馏水溶解为浓储液（约10～100mg/ml）。4℃冷藏备用，用时用培养基配成所需的浓度。
1.2 动物与细胞 NG108-15细胞从中国科学院上海生化细胞生物学研究所细胞库购进;NIH小鼠（7～8周龄，体重18～22g）由广东省医学实验动物中心提供，合格证号2004A018。
1.3 仪器 SL MODEL TC2323二氧化碳培养箱（美国芝加哥）。Eppendoff5415D离心机（德国）;ELx800Universal酶标仪（美国）。ZYY92-Ⅱ超声波细胞粉碎仪;Pharmaspec UV1700S可见紫外分光光度计（日本Shimadzu）;250ml磨口瓶、秒表、动物电子天平、断头器。
1.4 试剂 DMEM培养基、D-Hanks平衡盐干粉、胰蛋白酶、胰酶抑制剂均为Gibco产品。MTT［3-（4，5-dimethyl-thiazol-2-yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，Sigma］:以1mg/ml的水溶液分装冻存于-20℃备用。
100mM的H 2 O 2 制备:市售30%H 2 O 2 （8.8235M，Sigma）加三蒸水稀释88.235倍混匀，10μm微孔滤膜过滤，4～8℃保存1个月，用时稀释到最终浓度。
乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）及还原型谷胱甘肽（GSH），还原型谷胱甘肽氧化酶测定试剂盒（GSH-Px）由南京建成生物工程公司提供。
凡士林、钠石灰、亚硝酸钠，其他试剂均为国产分析纯。
2 实验方法
2.1 抗氧化应激作用
2.1.1 NG108-15细胞培养 按文献方法 ［10］ 稍作改进。将在液氮中冷冻保存的NG108-15细胞复苏接种于盛有含10%胎牛血清、青、链霉素各100μg/ml的DMEM培养基）培养瓶/板中，置于CO 2 孵箱中培养2～3天后;0.25%胰蛋白酶消化后，加入上述含血清的DMEM培养基中止消化反应，经吹打分散，200目细胞筛过滤后，200×g离心5min，以培养基将细胞调至密度为（1～2）×10 5 /ml，接种至培养板中，置CO 2 孵箱中（CO 2 含量为5%）37℃孵育培养传代。
2.1.2 柿叶水提物对培养NG108-15细胞的IC 50 测定 传代培养的NG108-15细胞，接种96孔板，每孔100μl，放入CO 2 培养箱中培养48h。加入不同浓度药液（10μl/孔），再培养24h后照MTT法 ［11］ （加入5mg/ml的MTT溶液20μl，放入培养箱培养4h，小心吸去上清加100μl的DMSO，摇匀，5min后测定490nm处OD值），计算活细胞的百分率。
2.1.3 过氧化氢（H 2 O 2 ）引起NG108-15损伤细胞生存率测定 传代培养的NG108-15细胞接种于96孔板，每孔100μl，放入培养箱培养48h。加0.5～10mM的H 2 O 2 10μl到培养液中，终浓度为50～1000μm/l，放入培养箱培养24h。MTT法 ［11］ 测定计算活细胞的百分率。
2.1.4 柿叶水提物对H 2 O 2 损伤NG108-15细胞的保护作用
2.1.4.1 对H 2 O 2 引起损伤的NG108-15细胞活力的影响 传代培养的NG108-15细胞接种于96孔板，放入培养箱培养48h。加入不同浓度药液，每孔10μl，至终浓度为柿叶水提物5.0、20、100μg/ml、芦丁10μg/ml;药物作用2h后加入3.3mM的H 2 O 2 10μl，至终浓度为300μm/L，冲击10h，MTT法 ［11］ 测定计算细胞活力的百分率。吸取收集培养液，按南京建成生物工程公司生化测定试剂盒方法测定培养基中乳酸脱氢酶（LDH）。
2.1.4.2 对H 2 O 2 引起损伤的NG108-15细胞的内源性抗氧化物质的影响 NG108-15细胞传代接种于盛有DMEM培养基的6孔细胞培养板中，每孔2ml（细胞密度约为1～2×10 5 /ml），培养48h至NG108-15细胞约为0.8～1.1×10 7 ），加入不同浓度柿叶水提物药液（20μl/瓶），至终浓度为柿叶水提物5.0、20、100μg/ml、芦丁10μg/ml，培养2h，加入H 2 O 2 溶液（20μl/瓶）至终浓度为300μmol，冲击培养10h，吸去培养基，加入终浓度0.25%胰蛋白酶消化细胞2～5min，用含血清的RPMI1640培养基中止消化，1500rpm离心5min;收集细胞约（3～5）×10 6 ，并用冰冻的（4℃）生理盐水 按1∶99制成单细胞混悬液，迅速放入液氮中，然后在冰浴中将细胞用超声细胞破碎仪破碎细胞（400A，100W，5秒/次，间隔10秒，反复5次）制成1%的匀浆液，匀浆液经14000rpm、4℃离心15min，取上清液按南京建成生物工程公司各相关指标生化测定试剂盒方法测定丙二醛（MDA）含量、还原型谷胱甘肽氧化酶（GSH-Px）活性及还原型谷胱甘肽（GSH）含量，蛋白定量用考马斯亮蓝法 ［12］ 。观察不同给药浓度对培养神经细胞的培养液LDH活性和培养细胞匀浆中GSH、MDA含量和GSH-Px活性变化的影响。
2.2 小鼠耐缺氧实验 ［13］
2.2.1 剂量组别 设柿叶水提取物50mg、100mg、300mg/kgBW三个剂量组及纯净水对照组，每天灌胃给药一次。柿叶水提物用前以纯净水调配成各剂量组所需浓度。
2.2.2 常压耐缺氧实验 各剂量组灌胃连续10天分别给予不同浓度柿叶水提物，对照组给予等容量蒸馏水，于末次灌胃后1h，将各组小鼠分别放入盛有10g钠石灰的250ml磨口瓶内（每瓶1只），用凡士林封瓶口，盖严使之不漏气，立即计时，以呼吸停止为指标，观察记录小鼠因缺氧而死亡的时间。
2.2.3 亚硝酸钠中毒存活实验 各剂量组灌胃连续10天分别给予不同浓度柿叶水提物，对照组给予等容量蒸馏水，于末次灌胃后2h，各组动物按200mg/kg·bw剂量腹腔注射亚硝酸钠（注射量为0.10ml/10g·bw），立即计时，记录动物存活时间。
2.2.4 急性脑缺血性缺氧实验 各剂量组灌胃连续10天分别给予不同浓度柿叶水提物，对照组给予等容量蒸馏水，于末次灌胃后2h，各组动物（在乙醚浅麻醉下）自颈部逐只断头，立即按秒表记录小鼠断头后张口喘气停止时间。
2.3 统计学处理 所有数据用SPSS11.0软件包进行方差分析统计。数据以ˉx±s表示，用方差分析和t检验，P<0.05为差异有显著性。
3 实验结果
3.1 抗氧化作用
3.1.1 柿叶水提物对NG108-15细胞的IC 50 1～100μg/ml的柿叶水提物对NG108-15细胞的生长无明显影响，大于或等于500μg/ml的柿叶水提物能抑制NG108-15细胞的生长，并有剂量依赖性;其抑制NG108-15细胞的生长的IC 50 为1280μg/ml（见表1）。
表1 柿叶水提物对NG108-15细胞活力（%）的影响（略）
注:与对照组比较: * P<0.05; ** P<0.01，下同
3.1.2 柿叶水提物对H 2 O 2 损伤NG108-15细胞活力的影响 100～1000μM的H 2 O 2 可引起的NG108-15细胞活力剂量依赖性减少，大于300μM H 2 O 2 可引起的细胞活力剧失，H 2 O 2 抑制NG108-15细胞的生长的IC 50 为450μM/L。
预先给予柿叶水提物5～100μg/ml，可使300μM的H 2 O 2 引起的NG108-15细胞活力降低幅度减轻并向正常范围恢复，对LDH从细胞内的漏出也有明显抑制作用，二种作用均有明显剂量依赖性，见表2。
3.1.3 柿叶水提物对氧化应激损伤细胞的细胞内源性抗氧化物质的影响 NG108-15细胞经300μM的H 2 O 2 冲击10h氧化应激损伤处理，培养液中LDH含量增加，表明细胞膜可能受损、胞内物质渗漏出胞外增加;而细胞内GSH-PX活性和GSH含量降低，细胞内MDA含量升高，表明胞内脂质氧化产物增多，而胞内抗氧化物质减少。预先给予柿叶水提物5～100μg/ml培养液中LDH含量增加的幅度下降，细胞内GSH-PX活性和GSH含量的降低幅度减轻，MDA含量向正常范围恢复，这些作用均有明显剂量依赖 性。见表3。
表2 柿叶水提物对H 2 O 2 冲击NG108-15细胞活力和LDH漏出率的影响（略）
注:与300μM的H 2 O 2 模型组比较: # P<0.05; ## P<0.01（下同）
表3 柿叶水提物对H 2 O 2 冲击G108-15细胞细胞匀浆（略）
注:这些结果提示柿叶水提物有明显的抗氧化应激损害作用及机制
3.2 柿叶水提物抗缺氧作用
3.2.1 对小鼠常压耐缺氧存活时间的影响 从表4可见，
柿叶水提取物中、高剂量组于纯水对照组比较，常压耐缺氧存活时间明显延长，差异有显著性（P<0.05～0.01）。
表4 柿叶提取物对小鼠常压耐缺氧存活时间的影响（略）
注:剂量组与对照组比较 * P<0.05， ** P<0.01（q检验）（下同）
3.2.2 柿叶提取物对小鼠亚硝酸钠中毒缺氧存活时间的影响 从表5可见，中低剂量组与对照组比较，亚硝酸钠中毒缺氧的存活时间明显延长，差异有非常显著性（P<0.01）。
3.2.3 柿叶水提物对小鼠急性缺血性缺氧喘气时间的影响 从表6可见，柿叶水提物各剂量组与对照组比较，急性脑缺血性缺氧的喘气时间明显延长，差异均有显著性（P<0.05～0.01）。
表5 柿叶提取物对小鼠亚硝酸钠中毒缺氧的存活时间的影响（略）
表6 柿叶水提物对小鼠急性缺血性缺氧喘气时间的影响（略）
4 讨论与结论
NG108-15细胞株是由Hamprecht小组在1973年建立的一种由小鼠神经细胞瘤和大鼠神经胶质细胞杂交融合的细胞株，兼有神经元和神经胶质细胞的生理生化等生物学特性，容易培养和观察;在国外的文献上被广泛用来当作研究神经元和神经胶质细胞功能的模式细胞 ［10］ 。NG108-15细胞在氧化应激的条件下细胞内GSH含量降低，MDA含量升高，LDH渗出胞外增多，发生细胞凋亡，这与体内的大脑神经元细胞在缺血或缺血缺氧的条件下引起氧化应激时发生生理生化变化有很好的吻合，可用来观察药物对神经元细胞的功能变化的影响 ［14］ 。
本文采用300μM的H 2 O 2 冲击培养的NG108-15细胞10h的氧化应激模型，诱导细胞损伤，细胞发生胞内GSH-PX酶活性和GSH含量降低，MDA含量升高，观察柿叶水提物对氧化应激引起NG108-15细胞损害的保护作用，发现柿叶水提物能提高神经细胞在氧化应激中的活力，减少胞内LDH漏出、缓解氧化应激引起的细胞内GSH-PX酶活性和GSH含量降低及MDA含量升高。提示柿叶水提物有抗氧化保护作用。
抗缺氧实验结果表明，每日分别灌胃给予50mg、100mg、300mg/kg BW剂量的柿叶水提物，连续10天。柿叶水提物可延长小鼠常压缺氧存活的时间;可延长小鼠亚硝酸钠中毒缺氧的存活时间;并能延长小鼠急性脑缺血性缺氧的喘气时间。提示柿叶水提物有提高动物缺氧耐受力的功能。
柿叶水提物片中含有大量酚性有机酸、黄酮和香豆素类成分，其主要有效成分是酚酸和黄酮 ［15］ 。这些含酚羟基的成分具有很强的生物抗氧化作用。柿叶水提物中酚酸和黄酮类成分可能是其抗氧化应激的重要活性成分;但其中何种成分起主要作用又待进一步研究阐明。
提高机体缺氧耐受力功能是一种综合功能，它可能包括了改善血液循环功能，提高组织供氧能力和拮抗缺氧敏感的心脑组织对缺氧引起的慢性组织细胞损伤等多方面功能。柿叶提取物能改善动物心脏功能与血流动力学，增加脑血流量的影响并能抗氧化应激损伤 ［8］ ，这此作用可能与其抗缺氧作用有关。
【参考文献】
1 Halliwell B.Free radicals and human disease where are we now.J，LabClin Med，1992，119:598-620.
2 Baringa M.Stroke damaged neurons may commit cellular suicid.Sci-ence，1998，281（5381）:1302-1303.
3 宋立人.现代中药学大辞典.北京:人民卫生出版社，2001，1430.
4 广西卫生厅.广西中药材标准.南宁:广西科技出版社，1992，70，243.
5 韩克慧，韩道昌，张益民.柿树的药理和临床应用.中成药研究，1983，（7）:27-28.
6 续建伟.柿叶的营养价值和开发前景.中国保健营养，1990，（2）:362.
7 林赛容.柿叶茶抗氧化、降血脂作用的实验研究.海峡药学，1996，8（4）:14-15.
8 王树松.柿叶的研究进展.河北中医，1998，20（1）:68-69.
9 曹彤.柿叶抗氧化作用的研究.中国食品添加剂，1996，（4）:4-6.
10 Hamprecht B.Structural，electrophysiological，biochemical and phar-macological properties of neuroblastoma-glioma cell hybrids in cell culture.Int Rev Cytol，1977，49:99-170.
11 Hansen M B，Nielsen S E，Berg K.Re-examination and further de-velopment of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill.J Immunol Methods，1989，119:203-210.
12 Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of mi-crogram quantities of protein utilizing the principle of protein-dyebinding.Anal Biochem，1976，72:248-254.
13 陈奇.中药药理研究方法学.北京:人民卫生出版社，2000，65.
14 Ken-ichi Tanaka，Naoko Fujita，Michiyo Yoshioka，et al.Immuno-suppressive and non-immunosuppressive immunophilin ligands im-prove H2 O2 -induced cell damage by increasing glutathione levels in NG108-15cells.Brain Research，2001，889:225-228.
15 Bei Weijian，Peng Wenlie，Xu Anlong，et al.Protection effects ofNaoxingqin against H2 O2 induced injury in neuron cell of NG108-15.Neuroscience Letter，2004，363:262-265.
* 基金项目:本研究为广州市科技局2002年度重点科技攻关项目;广州市名优中成药中药现代化研究专项基金资助项目，编号:2002Z2-E5081
作者单位:510405广东广州，广州中医药大学药理教研室
（编辑:黄 杰）