点击显示 收起
【摘要】 目的 为了检验葡萄多酚的生物安全性。 方法 对葡萄多酚样品进行小鼠急性毒性实验和小鼠遗传毒性实验。 结果 小鼠急性和遗传毒性测试均为阴性。对大鼠喂养30天的实验表明，在实验期内各实验组动物生长发育良好，动物体重、食物利用率、血常规、血生化、脏器系数等各项指标均在正常值范围内，与对照组之间差异无显著性（P>0.05）。病理组织学检查无异常。 结论 表明该物质对大鼠各项观察指标未产生明显毒性作用。
【关键词】 葡萄多酚;毒理学
Study on toxicology of grape procyanidins
ZHANG Ai-jun，SHEN Ji-hong.
First Institute of Oceanography，SOA，Qingdao266061，China
【Abstract】 Objective To evaluate biologic security for grape procyanidins.Methods The mouse acute toxicity test and heredity toxicity test of grape procyanidins were ivestigated.Results It was shown that all tests of acute and heredity toxicity were negative.The study of rats on30days feeding showed that the experimental groups had been in good state，and the body weight，food intake，haematological profile，viscera modulus had been in ordinary scope.There were no significant difference between test group and control group（P>0.05）.Conclusion Results from this study indicate a lack of toxicity for grape procyanidins.
【Key words】 grape procyanidins;toxicologicaly
葡萄多酚（Grape Proanthocyanidins，GPC）是从葡萄籽中提取的多酚类化合物 ［1］ 。主要含低聚原花青素（Oligomeric Proanthocyanidins），原花青素拥有强有力的抗氧化能力，在体内其抗氧化、清除自由基能力是维生素E的50倍、维生素C的20倍 ［2］ 。国外关于原花青素的功能研究较多，在日本厚生省已于1996年批准把葡萄多酚列入《天然食品剂名单》 ［3，4］ 中。近几年，国内葡萄多酚的研究也逐步热起来，将葡萄多酚开发成为保健品或药品，必需进行相关的生物安全性分析评价。因此，本文开展了葡萄多酚毒理学研究，为葡萄多酚开发应用保健品或药品提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 样品 葡萄多酚，红棕色粉剂（水分4.4%，灰分1.3%，原花青素93.62%），青岛海隆达生化科技有限公司。原花青素标准品，sigma公司提供。
1.2 实验动物 Wistar大鼠（医动字第01-3008号），昆明种小白鼠（医动字第01-3001号），购自中国医学科学院实验动物研究所繁殖场。以小白鼠为材料进行毒理学实验;以大鼠为材料进行生理生化实验。
1.3 实验方法
1.3.1 小鼠急性毒性实验 选用健康昆明种小白鼠20只，雌雄各半，小鼠体重为18～22g，空腹16h后，以10g/（kg·bw）剂量一次性灌胃后，连续观察14天，记录中毒表现及死亡情况。
1.3.2 艾姆斯（Ames）实验 采用经鉴定符合要求的鼠伤沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97、TA98、TA100、TA102四株实验菌进行实验。采用多氯联苯（PCB）诱导的大鼠肝匀浆作为体外代谢活性系统。根据毒性测定结果，实验设313、625、1250、2500、5000μg/皿，共5个剂量，同时设自发回变组和阳性对照组。阳性对照组试剂分别为（1）2，4，7-三硝基-9-芴酮，0.2μg/皿;（2）2-AF，10μg/皿;（3）正定霉素，10μg/皿;（4）NaN3，10μg/皿;（5）MMC，4μg/皿;（6）1，8-二羟基蒽醌，50μg/皿。在顶层琼脂中加入0.1ml实验菌液、0.1ml受试物溶液和0.5mlS-9混合液（当需要代谢活化时），混匀后倒入底层培养基平板上。37℃培养48h，计数每皿回变菌落数。如果受试物的回变菌落数是自发回变菌落数的2倍以上，并具有剂量-反应关系者定为阳性。整套实验在相同条件下重复做两次。
1.3.3 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验 体重为25～30g小白鼠50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。受试物剂量分别为1250、2500、5000mg/（kg·bw），以40mg/（kg·bw）剂量的环磷酰胺为阳性对照，蒸馏水为阴性对照，间隔24h，灌胃2次，末次给受试物后6h，处死动物，取胸骨骨髓涂片，甲醇固定，Giemsa染色，在光学显微镜下，每只动物计数1000个嗜多染红细胞（PCR），微核发生率以含微核的PCR千分率计。
1.3.4 小鼠精子畸形实验 用体重30～35克的性成熟雄性小鼠25只，随机分为5组，每组5只，受试物剂量同小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验，以40mg/（100g·bw）剂量的环磷酰胺为阳性对照，蒸馏水为阴性对照，每日灌胃，连续5次，末次灌胃后35天处死动物，取附睾制片，伊红染色，每只动物计数1000个结构完整的精子，计算畸变精子发生率（以百分率计）。
1.3.5 大鼠30天喂养实验 用体重60～80g断乳大鼠80只，随机分为阴性对照组及3个受试组，每组20只，雌雄各半。阴性对照组给予蒸馏水，3个受试组给予受试物，剂量分别为20mg/（100g·bw），10mg/100g·bw，5mg/（100g·bw），为人每日推荐用量的100倍、50倍和25倍。灌胃给予受试物，连续30天。血常规用AITAIKE CA-500型全自动血球计数仪检测，生化指标用Biosystem BTS370型全自动生化分析仪检测。
1.4 统计学处理 所有数据均经PEMS统计软件包处理。
2 结果
2.1 急性毒性实验测定结果 灌胃给予受试物后，两种性别的小鼠均未见明显的中毒症状，14天内动物无死亡。因此认为，该受试物对两种性别小鼠的急性毒性半致死浓度LD50>10g/（kg·bw），见表1。根据急性毒性分级标准，该葡萄多酚属于实际无毒物质。
表1 葡萄多酚对小鼠急性毒性实验结果（略）
2.2 遗传毒性实验检测结果
2.2.1 Ames实验测定结果 第1次和第2次实验结果表明，该受试物各剂量组回变菌落数均未超过溶剂对照菌落数2倍，亦无剂量-反应关系详见表2。说明在加与不加S-9时受试样品对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102四株实验菌株均未出现遗传毒性。
表2 葡萄多酚的Ames实验结果（略）
2.2.2 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验结果 通过小鼠骨髓嗜多染红细胞微核实验可知，葡萄多酚各剂量组微核率与阴性对照组比较差异无显著性（P>0.05），而环磷酰胺阳性对照组与阴性对照组比较差异有显著性（P<0.01）见表3，表明葡萄多酚对小鼠骨髓嗜多染红细胞的产生无影响。
2.2.3 小鼠精子畸形实验结果 该受试物各剂量组小鼠精子畸形发生率与阴性对照组比较差异无显著性（P>0.05），而环磷酰胺阳性对照组与阴性对照组比较差异有显著性（P<0.01）见表4。由此可知葡萄多酚对小鼠精子畸形发生率无影响。
2.3 大鼠喂养实验测定结果
2.3.1 大鼠的一般表现、体重、食物利用率测定结果 在大鼠喂养30天过程中，未出现拒食现象，生长发育、活动情况正常。大鼠体重和食物利用率测定结果表明，各实验组大鼠体重与对照组之间差异无显著性，各组动物体重增加、进食量及食物利用率差异均无显著性（P>0.05）。说明受试样品对大鼠生理活动的影响无差异。
2.3.2 大鼠的血常规及生化指标测定结果 对大鼠的血常规及生化指标测定结果表明，各实验组的血红蛋白、红细胞计数、白细胞计数及其分类、血生化指标（谷草转氨酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、尿素氮、肌酐、甘油三酯、胆固醇、血糖、总蛋白、白蛋白）均在正常范围内，与阴性对照组之间差异无显著性（P>0.05）。
表3 葡萄多酚对小鼠骨髓微核发生率的影响（略）
注:与阴性对照组比较差异有显著性（P<0.01）
表4 葡萄多酚对小鼠精子畸形发生率的影响（略）
注:与阴性对照组比较差异有显著性（P<0.01）
2.3.3 大鼠组织病理学检查结果 喂养30天的大鼠进行组织病理学检查结果表明，各实验组大鼠的肝、肾、脾、胃、十二指肠、睾丸或卵巢等脏器均未发现异常。与对照组比较，实验组大鼠的脏器系数（指肝、肾、脾）差异无显著性（P>0.05）。说明 受试样品对大鼠内脏及其它组织均未造成病理改变。
3 讨论
对葡萄多酚样品喂养大鼠实验表明，30天内大鼠生长发育良好，各实验组动物体重、体重增加、进行量、食物利用率、血常规、血生化以及脏器系数等各项指标均在正常值范围内，与对照组之间差异无显著性。该受试物进行小鼠急性毒性实验，LD50>10g/kg·bw，说明该物质属实际无毒物质。小鼠遗传毒性实验（Ames实验、骨髓嗜多染红细胞微核实验、精子畸形实验）。结果表明，急性和遗传毒性测试均为阴性。病理组织学检查没有发现异常，表明该物质对大鼠各项指标未产生明显毒性作用。
本研究表明，以人体推荐量（0.133mg/kg·bw）的25～100倍的葡萄多酚，喂食小鼠、大鼠均无明显毒性作用。因此，本研究结果为今后葡萄多酚用于人体的保健或一些预防药物的开发研制，提供了科学依据。
参考文献
1 王传现，钟进义.葡多酚对活性氧自由基的清除作用研究.营养学报，2001，23（2）:170-173.
2 钟进义，栗世如.葡多酚对小鼠DNA与染色体放射性损伤的防护作用.中华劳动卫生职业病杂志，1999，17:211-213.
3 Ricardo-Da-Silva LM，Rigaud J，Cheynier V，et al.Procyanidin dimmers and trimers from grape seeds.Phytochemistry，1991，30（4）:1259-1264.
4 Kanner J，Frankel E，Granio R，et al.Natural antioxidants in grapesand wines.J Agric Food Chem，1994，42:64-68.
* 基金项目:国家高新技术发展计划（863）资助项目（2001AA620502）
作者单位:266061山东省青岛市国家海洋局第一海洋研究所
（编辑罗 彬）