高效液相法测定六味地黄丸(浓缩丸)中丹皮酚的含量

　　【摘要】  目的  采用HPLC法测定六味地黄丸(浓缩丸)中丹皮酚的含量。方法  以十八烷基硅烷键合硅胶为填空剂；甲醇-水(50∶50)为流动相；检测波长为274nm。结果  丹皮酚含量在5～25μg/ml范围内具有良好线性关系，r=1.0，平均加样回收率为96.51%，RSD=0.59%(n=5)。结论  结果表明，该方法方便快捷、准确、灵敏度高、重现性好。

　　【关键词】  丹皮酚含量测定；六味地黄丸(浓缩丸)；高效液相色谱
  
    六味地黄丸(浓缩丸)是由牡丹皮等六味中药组成的复方制剂，收载于卫生部药品标准十一册［1］。本品具有滋阴补肾功效，临床多用于肝肾阴虚、虚火上炎腰膝酸软、头晕耳鸣等症。处方中牡丹皮是六味地黄丸(浓缩丸)中“三补三泻”中的“一泻”，丹皮酚是牡丹皮的主要有效成分，也是六味地黄丸(浓缩丸)含量测定的主要指标之一。六味地黄丸(浓缩丸)中丹皮酚含量测定是采用水蒸气蒸馏-紫外分光光度法，操作耗时，方法陈旧。而采用高效液相法(HPLC)测定六味地黄丸(浓缩丸)中丹皮酚的含量，测定快捷、准确、可靠。

　　1  仪器与材料

　　1.1  仪器  高效液相色谱仪：Agilent1100；紫外分光光度计：UV755B。超声仪：HS10260D。

　　1.2  试药  甲醇为色谱纯(天津四友批号为030603101)；水为二次重蒸水；其他试剂为分析纯。

　　1.3  对照品  丹皮酚对照品0708-9704(购于中国生物制品检定所)。

　　1.4  样品  六味地黄丸(浓缩丸)(批号040315、040517、040805均由黄山天目药业有限公司提供)。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件与系统适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇∶水（70∶30)为流动相，流速1ml/min；进样量10μl；检测波长274nm，理论板数按丹皮酚峰面积计算不低于4000［2］。

　　2.2  对照品贮备溶液制备  取丹皮酚对照品适量，精密称定，加甲醇制成1ml含0.20mg(实配为0.220mg/ml)的溶液，即得丹皮酚对照品贮备溶液。

　　2.3  样品溶液制备  取六味地黄(浓缩丸)丸，捣碎，取0.3g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50ml,密塞，称定重量，超声处理45min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

　　2.4  丹皮酚线性关系的考察  精密吸取丹皮酚对照品贮备溶液(0.220mg/ml)1ml,2ml,4ml,5ml,6ml置50ml量瓶中，分别用甲醇稀释至量，配成1ml含4.4μg、8.8μg、17.6μg、22.0μg、26.4μg的溶液，在上述色谱条件下各进样10μl，记录色谱图，以峰面积为纵坐标(Y)与含量为横坐标(X)得回归方程为：Y=51588955.11X+99.269,r=1.0，丹皮酚在范围为5～25μg/ml范围内具有良好线性关系。

　　2.5  精密度试验  精密吸取同一丹皮酚对照品溶液(22.0μg/ml)，重复进样5次，每次10μl，以丹皮酚的峰面积计，RSD为0.96%(n=5)。结果表明，精密度较好(见图1)。

　　图1  丹皮酚对照品HPLC图谱　略

　　2.6  样品测定  精密吸取上述样品溶液，进样量20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图(见图2)，以外标法计算样品中的丹皮酚的含量，结果见表1。

　　图2  样品HPLC图谱　略

　　表1  六味地黄丸(浓缩丸)丹皮酚含量试验结果　略

　　2.7  重复性试验  同一批样品取5份，分别按2-6项下操作测定，结果样品的丹皮酚RSD为0.69%，重复性良好。结果见表2。

　　表2  重复性试验　略

　　2.8  稳定性试验  样品制成的供试品溶液，分别在0、0.5、1、3、6、10h测定，RSD为0.03%，稳定性良好，见表3。

　　表3  稳定性试验　略

　　2.9  加样回收试验  精密称取六味地黄丸(浓缩丸)0.3g，加入0.31mg/ml丹皮酚对照品溶液，按2.6方法测定，结果丹皮酚含量平均回收率为96.51%，RSD=0.59%，见表4。

　　表4  加样回收试验　略

　　2.10  空白对照试验  按处方比例制备六味地黄丸(浓缩丸)阴性对照品，按含量测定方法项下处理，经HPLC法进样5μl测定，发现在相同色谱条件下，阴性对照品在丹皮酚相同保留时间处无吸引峰。结果见图3。

　　图3  阴性对照品HPLC图谱　略

　　2.11  丹皮酚含量两种测定对比试验  按六味地黄丸(浓缩丸)原质量标准［1］项下丹参酚含量测定方法测定样品(050509)丹皮酚含量：精密称取上述同批号六味地黄丸(浓缩丸)样品1g，用水蒸汽蒸馏，收集蒸馏液约450ml，置500ml量瓶中，加水稀释至刻度，照分光光度法(中国药典2000版一部附录VA)，在275nm波长处测定吸收度，按丹皮酚(C9H10O3)的吸收系数(E1%1cm)为862计算，即得。结果见表5。同时照规定的高效液相方法测定此批样品(050509)，结果见表6。

　　表5  分光光度法测得的六味地黄丸(浓缩丸)(050509)丹皮酚含量试验结果　略

　　表6  高效液相法测得的六味地黄丸(浓缩丸)(050509)丹皮酚含量试验结果　略

    比较上述两种方法的结果：(1)精密度：①两种方法G值均小于1.71，表明检测数据均无异常值；②F=S12/S22=0.00015/0.00003=5＜F表(1=5-1=4，2=5-1=4,F表=6.39)，表明S1和S2精密度差异无显著性。即测定六味地黄丸(浓缩丸)中丹皮酚含量，使用高效液相色谱法与使用分光光度法在精密度方面差异无显著性。
(2)准确度：两种方法存在差异，分光光度法比高效液相色谱法测出的含量平均高出10.4%［(0.91-0.824)/0.824×100%］。我们将六味地黄丸(浓缩丸)经水蒸汽蒸馏的蒸馏液(原作为分光光度法测定丹皮酚的样品溶液)作为样品，进样高效液相色谱仪中，记录色谱图(见图4)，发现在色谱图内有杂质峰存在，这就是测定样品的丹皮酚含量用分光光度法比高效液相色谱法虚高的原因。

　　图4  蒸馏液HPLC图谱　略

　　3  讨论

　　通过水蒸汽蒸馏-紫外分光光度法与样品超声提取液-HPLC法测定样品含量对比，HPLC法更适合，方便快捷，灵敏度高，重现性好，准确可行。

　　【参考文献】

　　1  卫生部.药品标准十一册.标准号WS3-B-2102-96.

　　2  国家药典委员会.中华人民共和国药典一部，2005，401.

　　作者单位： 245000 安徽屯溪，黄山市药品检验所

　　(编辑：若  木)