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【摘要】 目的 探讨NO对心肌缺血再灌注（I/R）细胞凋亡的影响。方法 将原代培养新生大鼠心肌细胞随机分为(1)正常对照组及I/R对照组、(2)NO供体L-精氨酸（L-Arg）组、(3)NOS抑制剂L-硝基-精氨酸（L-NNA）组。心肌细胞用模拟缺血液培养2h后，再用模拟再灌注液培养1h创建缺血再灌注模型，L-Arg组和L-NNA组于再灌注时分别给予L-Arg和L-NNA与心肌细胞共同孵育。以LDH的含量和心肌细胞凋亡百分率以及凋亡指数为损伤检测指标。结果 心肌细胞缺血再灌注后，细胞培养上清液中NO含量和LDH含量增加,TUNEL染色检测到大量阳性凋亡细胞;L-Arg组NO、LDH含量以及细胞凋亡率和凋亡指数均较对照组明显增加，而L-NNA组上述指标均显著降低。结论 NO可通过诱导心肌细胞凋亡而加重缺血再灌注损伤。
【关键词】 一氧化氮；心肌细胞；缺血再灌注；凋亡
The effect of nitric oxide on ischemia-reperfusion cadiocyte apoptosis of rats
WU Qing，WANG Jun，YOU Min，et al.
Sichuan Continuing Education Collge of Medical Sciences, Chengdu 610041,China
【Abstract】 Objective To obseve the effect of nitric oxide(NO )on ischemia-reperfusion(I/R) cadiocyte apoptosis.Methods Primary cultured cadiocytes of neonatal rats were random divided into (1)normal control group and I/R control group,(2)NO donor L-Arg group and,(3) nitric oxide synthase(NOS) inhibitor L-NNA group. Checking up the levels of NO and LDH in each group, and apoptosis was detected by TUNEL and flow cytometer.Results After I/R, levels of NO and LDH had been risen clearly, and the index and the percentage of apoptosis increased obviously too. In L-Arg group, the former index constantly risen,but in L-NNA group ,the former index obviously decreased,compared with control group.(both P＜0.01).Conclusion NO may incresae rats cardiomyocytes I/R injury by induced cadiocytes apoptosis.
【Key words】 NO；cadiocyte;ischemia/reperfusion;apoptosis
细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤的特征性的病理生理变化，是心肌受损、心力衰竭发病机制中的重要环节。近年研究证实NO与心肌缺血再灌注（I/R）细胞凋亡有密切关系［1～3］，但其确切的效应目前尚无定论。我们前期的实验研究表明［4，5］，培养大鼠心肌细胞模拟缺血和缺血再灌注损伤（凋亡）时NO释放量明显增加。为进一步探讨NO 在心肌缺血再灌注中所起的作用，我们采用外源性NO供体L-Arg和NOS抑制剂L-NNA促进/抑制NO生成的方法，探讨NO与心肌缺血再灌注细胞凋亡的关系。
1 材料与方法
1.1 材料 TUNEL试剂盒（Bochringer Mannheim公司），高糖DMEM培养基（Hyclcne公司），胰蛋白酶（Gibcobrl 公司 美国），5-溴脱氧尿核苷、L-精氨酸、L-硝基精氨酸（Singma公司 美国），LDH、NO试剂盒（南京建成生物工程研究所）。
1.2 方法
1.2.1 心肌细胞培养和心肌细胞爬片制备 方法参见文献［4］，新生SD大鼠由四川大学医学实验动物中心提供。
1.2.2 缺血再灌注模型制备 缺血再灌模型参照文献报道方法［6］进行。
1.2.3 实验分组 将原代培养新生大鼠心肌细胞分为正常对照组、I/R 对照组、NO供体L-Arg组（ 浓度分别为100、200、400、800umol/L）和NOS抑制剂L-NNA组(浓度分别为0.1、1、10mmol/L)。各组心肌细胞均模拟缺血培养2h,模拟再灌注培养1h，造成缺血再灌注损伤。 L-Arg组和L-NNA组在缺血培养后，于再灌注培养的同时加入L-Arg/L-NNA共同孵育。
1.3 检测指标
1.3.1 心肌细胞鉴定 采用形态学结合免疫组化方法进行鉴定。
1.3.2 NO和LDH含量检测 收集各组心肌细胞培养上清液进行NO和LDH检测，方法按照试剂盒说明书进行。
1.3.3 TUNEL染色检测细胞凋亡及凋亡指数 取各组心肌细胞爬片放入4%甲醛溶液固定，按TUNEL试剂盒说明书原位检测凋亡细胞，阴性对照为不加TDT酶。以核阳性（细胞核呈黄褐色）为判定标准。凋亡指数按文献［4］方法计算。
1.3.4 流式细胞仪检测凋亡率 收集各组心肌细胞，2.5g/L胰蛋白酶消化，PBS调整细胞密度为3×109个/L,预冷的无水乙醇固定，送流式细胞仪检测室检测。
1.4 统计学处理 实验数据以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较用t检验，多组间比较用完全随机设计方差分析及多重比较。
2 结果
2.1 培养心肌细胞的生长情况及鉴定 培养心肌细胞生长状况良好，形态呈梭形或不规则三角形，胞体有明显的折光性。倒置显微镜下心肌细胞有伪足，并连接成片 ，搏动规则并同步，频率约80～100次/min。经ɑ-肌动蛋白单抗组化染色鉴定纯度达90%以上。
2.2 NO和LDH检测结果 心肌细胞缺血再灌注后NO、LDH含量显著高于正常对照组；L-Arg组显著高于缺血再灌注组（P＜0.01）(表1)；L-NNA组（1mmol/L和10mmol/L)显著低于缺血再灌注组（P＜0.01）(表2)。表明心肌缺血再灌注时NO生成增多，导致细胞膜性结构损伤，使细胞内LDH漏出增多。
2.3 TUNEL检测结果 心肌细胞缺血再灌注后TUNEL染色检测到大量的凋亡细胞（光镜下观心肌细胞核内出现不同程度的黄褐色染色，形状呈星月形或椭圆形，即判断为凋亡细胞），其凋亡指数显著高于正常对照组（P＜0.01）（表1） ；L-Arg组胞核着色更为明显，凋亡细胞和凋亡指数均显著高于缺血再灌注组（P＜0.01）（表1）。 L-NNA组（1 mmol/L和10 mmol/L)胞核着色明显减弱，其凋亡细胞和凋亡指数均显著低于缺血再灌注组（P＜0.01）（表2）。
2.4 流式细胞仪检测结果 心肌细胞缺血再灌注后流式细胞仪检测到凋亡峰，各组细胞凋亡率见表1和表2。
表1 L-Arg组NO和LDH含量、凋亡率(AR)、凋亡指数(AI)的变化 (略)
表2 L-NNA组 NO和LDH含量、凋亡率(AR)、凋亡指数(AI)的变化 (略)
3 讨论
细胞凋亡是心肌缺血再灌注损伤的特征性的病理生理变化，是心肌受损、心力衰竭发病机制中的重要环节；LDH是一种糖酵解酶，广泛存在于哺乳动物的细胞内，在血清和细胞培养液中LDH含量升高时常常作为细胞损伤的一种征象。实验中我们采用激发和抑制NO的合成方法—以LDH含量和细胞凋亡作为损伤指标观察 NO与心肌缺血再灌注损伤的关系。结果表明，外源性NO供体L-Arg 组NO产生量、LDH的漏出量以及细胞凋亡率和凋亡指数均显著高于对照组，而NO抑制剂L-NNA组上述指标均显著低于对照组，并显示出明显的浓度依赖效应（表1、2）。上述研究结果提示缺血再灌注时NO释放增多导致心肌细胞损伤加重，而NO释放水平下降则能减轻再灌注损伤。
NO在生物体内作为一种反应性极强的自由基，兼有第二信使和神经递质作用，同时又是一种效应分子，介导着机体多个系统的生理功能，但其分泌异常时又具有细胞毒性作用并中介一系列病理生理过程，导致细胞损伤甚至死亡。目前NO在缺血再灌注损伤（凋亡）中的作用争议很大， 多数研究支持NO的心肌保护作用，认为缺血再灌注时NO释放水平下降导致心肌损伤，于再灌注时给予NO供体和前体，则能维持局部NO水平，减轻再灌注损伤，并可抑制caspase酶、干预炎性反应而达到抗凋亡的作用［1、2］。而相反的报道则认为，当心肌缺血再灌注时NO过量生成时能降低心肌收缩功能，降低线粒体功能，加重心肌脂质过氧化损伤，并激活细胞内多种酶类并诱导细胞内原癌基因P53、Bcl-2、Bax、C-fos等蛋白表达，促使热休克蛋白及Fas蛋白表达，致使DNA断裂，从而促进细胞凋亡［3、7～10］。
综上，我们的实验结果提示缺血再灌注时的NO释放增多，是诱导细胞凋亡，加重培养心肌细胞缺血再灌注损伤的重要原因之一 。 但是，NO与缺血再灌注损伤（凋亡）的关系的确非常复杂，众多研究得出的结论存在如此大的差异，这可能与不同的实验条件、不同的实验方法、不同的实验动物以及不同的细胞株之间有密切关系，有待深入研究。
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基金项目：四川省卫生厅科学研究课题（030104）
作者单位：1 610041 四川成都，四川省卫生干部管理学院生理教研室
2 610041 四川成都，成都市防疫站
3 610041 四川成都，四川大学华西医院医学遗传研究室
(编辑：石 岚)