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Home医源资料库在线期刊中华医药杂志2005年第5卷第11期

临床紧急冷冻切片制作的应用研究

来源:中华医药杂志
摘要:【摘要】目的为了减少患者在手术台上的停留时间,必须缩短切片制作时间,提高制片的质量,如此可提高诊断准确率。方法将未经固定的组织块放入冷冻箱内,冷冻后切片5μm或10μm,即刻于固定液里固定20s,用HE染色。结论应用未经固定的组织块能够制出最好的切片,它需时少,效果好。冷冻切片Theapplicationresearch......

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    【摘要】  目的  为了减少患者在手术台上的停留时间,必须缩短切片制作时间,提高制片的质量,如此可提高诊断准确率。方法  将未经固定的组织块放入冷冻箱内,冷冻后切片5μm或10μm,即刻于固定液里固定20s,用HE染色。结果  实验结果令人满意,所有的组织结构没有被损害,细胞核和细胞浆被染得清晰、鲜艳,核仁易见,可获得极好的细胞核和细胞浆的形态学。结论  应用未经固定的组织块能够制出最好的切片,它需时少,效果好。

  【关键词】  临床;紧急;冷冻切片
   
  The application research of clinical urgent freezing section preparation

  CAI Jun-jie,ZHAO Fei,ZHANG Yan,et al.

  Department of Pathology,Basic Medical College of Southern Medical University,Guangzhou 510515,China

  【Abstract】  Objective  In order to reduce the time which the patient stayed on the operative table, it must be to short the time to make the section, to rise the quality to make the section, so as to rise the rate of diagnose exactly. Methods  The unfixed tissue blocks were put into the freezing chamber and cut it for 5 or 10 μm section at once after it were frozen,then put it into the fixactives for 20 seconds and stained with haematoxylin and eosin. Results  The results of the experiment was satisfactory. All the tissue structure havn’t damage. The nucleus and the cytoplasm were stained clearly and brilliantly. The nucleolus were easy to see it. It gives excellent nuclear and cytoplamic morphology. Conclusion  Applying the unfixed tissue blocks could make the best section. It was spent a little time and got a effective result.

  【Key words】  clinical;urgent;freezing section

    恒温箱冷冻切片制作质量的好坏直接关系到快速诊断的准确性,关系到对肿瘤良恶性诊断的作出,关系到患者肢体、脏器的存留。对于如此重要的问题,如何制作高质量的切片是解决上述问题的必要条件。
笔者根据几年来制作几千例各种组织冰冻切片的经历,谈谈如何制作好冰冻切片的问题。

  1  材料与方法

  1.1  材料  南方医院病理科每天做冷冻切片的病例:甲状腺及其组织50例;乳腺及其癌组织50例;肝及其癌组织50例,结肠及其癌组织50例;胃及其癌组织50例;淋巴结及各类病变组织50例等。切片厚度5~7μm。

  1.2  方法

  1.2.1  切片附贴于载玻片后,即刻用AAF、纯丙酮、10%福尔马林固定。

  1.2.2  切片附贴于载玻片后,用电吹风烘干后再用AAF、纯丙酮、10%福尔马林固定。

  1.2.3  冷冻切片的整个制作过程。中华医学会规定完成冷冻HE染色切片制备时间通常为20~25mins[1],为了减少患者在手术台上的等待时间,笔者经各时间段的严密操作及实验,摸索出一套制作程序,这套程序切片质量好,切片与石蜡切片无明显的差别,如此有利于诊断,减少或降低差错率。下面的时间操作是切实可行的:(1)组织块冷冻时间2min;(2)切片及附贴切片时间1min;(3)切片应用各种固定液固定30s;(4)切片染核3min;(5)切片分化2s;(6)切片水洗时间1s;(7)切片用氨水蓝化20s;(8)水洗1s;(9)伊红染色20s;(10)各级酒精脱水1min;(11)石碳酸二甲苯,二甲苯透明20s;(12)封固。整个过程8min,加上一些附加时间,保证在10min内完成制片过程,切片可以长期保存。

  2  结果

  切片附贴于载玻片即刻用AAF固定液固定的切片结果最好,该法省时,切片无脱落现象,细胞核染色清晰,核仁显示明显,组织结构清楚,无破坏等现象,应用纯丙酮和10%福尔马林不如前法。

  切片附贴于载玻片后,用电吹风烘干,继用AAF、纯丙酮和10%福尔马林固定液固定,细胞核、细胞核内结构融为一片,核仁无法见到,组织结构不如上法好,另外还费时,切片无脱落现象,此法较适合于不好切片的病例,需切较厚的切片。

  3  讨  论

  临床冷冻切片的病例,都属于快速诊断的病例,患者在手术台上等待着病理诊断结果,以便于决定手术范围,各脏器的存留。因此,必须尽一切可能争取时间,争取尽快早出切片,并保证质量。

  3.1  未固定的组织块经冷冻合适后切片  切片附贴于载玻片上,即刻放入AAF固定液中固定。这是保证能获得最佳切片的最好方法。这种做法的好处是:(1)省时,切片直接放入固定液中固定,不需吹干等所花费的时间;(2)能保证细胞内的各种物质不被破坏和导致变性,因为切片如果吹干,细胞由低温向室温及高温转变,如此可使细胞在这种温度的转化过程中发生变化仍至裂变,导致细胞内各物质的变化。Pearse指出,除非立即固定,否则细胞不可避免的要完全破坏,如使切片在玻片上融化,干燥时,这种现象尤易发生,无论如何这个方法总会产生扯裂或皱缩的人工假象,只要可能时就应避免[2];(3)所用AAF固定液中的醋酸能促进核的染色,增加染色的强度,保证切片在较短的染色时间里仍然能染出较佳的切片。有人担心这样做会使切片在染色时脱离载玻片,经几年来几千例的实践证明,这种担心是多余的。因为组织液含有蛋白,当它被附贴于载玻片时,这些蛋白就会紧紧地附贴于载玻片上,就如同以往石蜡切片为了增加切片的附贴,在载玻片上涂抹蛋白甘油一样,不至于脱离载玻片。另者,冷冻组织冷冻度较低,一般在-20℃左右,与载玻片相贴在一起时,由于载玻片在室温下是20℃左右,其温度差将近40℃左右,这种温度差的相互转移,可使切片紧紧地附贴于载玻片上,不会脱离载玻片。

  3.2  切片附贴于载玻片后,经电吹风吹干后,用AAF固定液固定  这种做法切片不会脱离载玻片,染色后观察切片尚可,但要仔细观察细胞中的微细变化就不行,只能观察细胞中的大体轮廓,这是因为切片附贴于载玻片后,用电吹风吹干,切片从-20℃突然升直70~80℃左右,随着温度的升高,切片中的各物质也会随之变化,由于高温,可导致蛋白的变性,整个细胞核都融为一团,分不清核内的微细结构,因此这种做法虽然能增加切片的附贴系数,但从观察细胞的微细变化程度来讲,该法是不可取的,它只适合于较难切,但需要做出较厚的切片。

  3.3  包埋剂的正确使用  包埋剂的主要作用是增加组织的粘附以及填充补缺的作用,如组织不完整和有空洞及缺口,如此可用包埋剂填补起来,以利于切出完整的切片。但有的人不是这样做,而是用包埋剂将整块组织包起来,这样做既浪费材料,又浪费冷冻时间,是不可取的。

  3.4  恒冷箱冷冻机的门窗不要随意打开  恒冷箱的门窗一经打开,热空气将会进入冷冻箱内,可影响箱内冷冻的组织和已切好的切片。如切好的切片遇热空气将会卷起来或者融化。因此,当打开窗附贴切片时,动作一定要快,熟练,否则切片将难以完美的附贴好。

  3.5  组织冷冻度要适中,以利于切片  组织于冷冻台上冷冻,要仔细观察组织的变化,当组织表面还有湿润状时,即可中断冷冻,进行切片,将表面一层尚未冻硬的组织修切去后,即可切出很好的佳片,此时冷冻度很利于切片。因为组织冷冻是自下而上,表面虽然没有冻得完全,把其修切去,下面的就已经符合切片的标准。但如果等到组织块表面布满霜时,再行修切切片,此时的切片时机最差,切片易粉碎,不完整。这是冷冻过度的现象,如要将其完整切出,必须将组织块的温度提高,再行切片。

  3.6  要注意切片的皱折  当切片切出后,有的是平躺在 平台上,这种贴片最容易附贴,但有的切片切出来后有皱折,这时要注意把切片摆平,可用冷冻的镊子将其拉直不要用室温下的镊子,因它可将切片融化 ,造成切片失败,必须重新切片。如果如此反复多次,必将影响制片的速度。

  3.7  关于切片的染色问题     冷冻切片的快速染色,也是冷冻切片技术中关键的部分,染色的好坏关系到很多方面的问题,如诊断准确率,切片的返切率等等。以往在染苏木素的时候,使用了许多号段和方法等进行。如酒精灯加热法,微波技术和超声波技术等,所有这些技术的应用,都是为了一个快字,但笔者认为,染色除了快以外,还必须要高质量,快速加热染色中,较容易引起切片脱离载玻片,造成返切率高。本文中用室温下染苏木素3min,是整个制片过程中最长的时间段,但这是值得的。因为切片经它染色后,细胞核着染清晰,为疾病的诊断提供充分的依据;室温下染色,切片较少脱离载玻片,返切率低;切片可长期保存。另者,整个制片时间也不长,仅控制在10min之内,是完全符合要求的,细胞核染色也可在1/2~1min完成,但这个时间段染色不够充分,效果不是很好。
  
  要做好恒冷箱快速冷冻切片,除了要掌握上述的问题外,还要掌握机器的性能及其使用,这可参考《如何制作好临床快速冰冻切片问题的探讨》一文[3]。

  【参考文献】

  1  中华医学会.临床技术操作规范,病理学分册.北京:人民军医出版社,2004,10-11.

  2  AGE皮尔斯.马仲魁译.组织化学理论和实用.北京:人民卫生出版社,1985,24-25.

  3  蔡俊杰,张彦,陈源,等.如何制作好临床快速冰冻切片问题的探讨.中国组织化学与细胞化学杂志,1998,7(3):246-260.

  作者单位: 510515 广东广州,南方医科大学基础医学院病理学教研室

  (编辑:若  木)

作者: 蔡俊杰赵菲张彦杨建芳 2006-8-19
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