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【摘要】 目的 观察不同类型ATP敏感性钾通道开放对高钾停跳离体兔心缺血再灌注损伤的保护作用，并探讨可能的保护机制。方法 采用离体兔心Langendorff灌注实验模型，离体兔心40只随机等分成五组（n=8）：对照组（C组）、Pinacidil组（P组）、Diazoxide组（D组）、5-HD+Pinacidil组（HP组）、5-HD+Diazoxide组（HD组）。离体兔心4℃标准St.Thomas停搏液（K+16mmol/L）至心脏停跳，45min后再灌注20min，药物于心脏停跳前灌注15min。对比观察Pinacidil、Diazoxide及其与5-HD合用时心脏的功能指标、冠脉血流量以及再灌注末心肌组织中腺苷酸含量、丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD) 活性和心肌酶的变化。结果 P组、D组、HP组再灌注后复跳时间、心功能的恢复率、心肌能量保存、SOD活性均显著高于C组，心肌酶、MDA的含量显著低于C组，HP组心功能的恢复、能量保存差于P组，心肌酶、MDA的含量高于P组。结论 肌纤维膜型(sarcKATP通道)和线粒体型(mitoKATP通道) KATP通道共同参与对心肌缺血再灌注损伤的保护作用,其中mitoKATP通道起主导作用。
【关键词】 mitoKATP通道；缺血再灌注损伤；离体家兔；心脏
The role of mitochondrial ATP sensitive potassium channel during ischemia-reperfusion in rabbit heart
YE Ying,XU Tie,LV Jian-nong.
The Center of Emergency,Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College,Jiangsu 221002,China
【Abstract】 Objective To investigate the protective effects of different ATP-sensitive potassium (KATP) channel opens, Pinacidil and Diazoxide , on myocardium injury in isolated rabbit hearts caused by ischemia/reperfusion and possible changes after application of ATP-sensitive potassium channel blocker,5-HD. Methods Observation was made on rabbit hearts perfused with a Langendorff apparatus. 40 rabbits were randomly divided into four selected groups: 1. Pinacidil;2. Diazoxide;3. 5-HD+Pinacidil;4. 5-HD+Diazoxide. All groups were subjected to 40 minutes occlusion, then followed by 20 minutes reperfusion as cardiac stopped functioning by cold cardioplegia. Any one of Pinacidil, Diazoxide , Pinacidil or Diazoxide mixed with 5-HD was infused 15 minutes before cardioplegic heart rested in experimental group.Hemodynamics variables, levels of adenine nucleotides and lipid peroxide of the myocardium were measured. Results (1)In Group P, Group D and Group HP, the recovery of myocardial contractility and heart rate were faster and MDA level of myocardium and had much lower levels of activities of cretinkinase (CK) and lactate dehydrogenase (LDH). Moreover levels of myocardial adenosine triphosphate (ATP)（P＜0.05 or 0.01）were much higher.(2)In Group HP, however, the recovery of myocardial contractility and heart rate could not be as good as Group P, MDA level of myocardium and release amount of albumen was higher than P group. Conclusion The ATP-sensitive potassium channel openes may enhance myocardial protection against ischmia /reperfusion injury. The above effect of myocardial protection was only partially closed down by ATP-sensitive potassium channel blocker: 5-HD. These results shows that selective pharmacological agents implicate mitochondria and sarcolemmal KATP channels are not important in ischemic cardioprotection.
【Key words】 mitochondrial ATP sensitive potassium channel;ischemia/reperfusion injury;isolated rabbit；hearts
1983年，Noma［1］应用膜片钳技术首先在豚鼠心肌细胞上发现ATP敏感性钾通道（KATP通道）。随着对KATP通道深入的研究发现KATP通道是将细胞代谢和细胞电活动耦联起来,从而调节细胞功能(如胰岛β2细胞的分泌功能、血管舒缩功能、缺血预适应中对心肌的保护作用等)的重要通道。本实验室的前期试验表明 ATP敏感性钾通道开放剂（KCOs）Pinacidil对离体兔心及外循环心内直视手术下的犬心缺血再灌注损伤具有保护作用，KATP通道的激活可能参与心脏内源性保护机制［2，3］。随着分子生物学技术的发展发现心肌细胞有sarcKATP通道和mitoKATP通道［4］，而哪型通道开放是心肌细胞获得保护的关键一直存在着争议。
本实验应用离体兔心Langendorff灌注模型观察分别以非选择性KATP通道开放剂Pinacidil和mitoKATP通道开放剂Diazoxide预处理对高钾停跳离体兔心缺血再灌注损伤的保护作用，以及mitoKATP通道阻断剂5-HD应用后其心肌保护作用的变化，并探讨其可能机制。
1 材料和方法
1.1 材料 健康家兔40只，体重2.2～2.5kg，雌雄兼用，由本校实验动物中心提供。Pinacidil、Diazoxide、5-HD为美国Sigma公司产品，丙二醛、ATP、蛋白测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品，其余试剂均为国产分析纯。
1.2 实验方法
1.2.1 离体心脏灌注模型的制备 兔耳缘注射肝素300u/kg，5min后击头部致昏，迅速开胸取出心脏连接于改良Langendorff灌注装置上，以95% O2和5% CO2饱和Krebs-Henseleit溶液（K-H）逆行灌注，温度37℃，灌注压力为10kPa， K-H液成分（mmol/L）：NaCl 118，KCl 4.7， NaH2PO4 1.19， MgCl2 1.19， CaCl2 2.5，NaHCO3 24.8， Glucose 11.1， EDTD-2Na 0.125，pH 7.4。
1.2.2 实验分组及步骤 离体心脏K-H液平衡灌注使心率稳定10min后，随机分为：(1)C组 (n=8)， St.ThomasⅡ晶体停搏液［成分(mmol/L):NaCl 110，KCl 16，CaCl2 1.2，NaHCO3 10，MgCl2 16，pH 7.8］经主动脉逆行灌注使心脏停跳(4℃，10ml/kg，灌注压为10kPa)，停止K-H液灌注45min后恢复37℃K-H液灌注20min。(2)P组和D组(各n=8)，在心脏停跳前增加Pinacidil（10μmol/L）或Diazoxide（30μmol/L）灌注15min，灌注压为10kPa，其余步骤同对照组。(3)HP组和HD组(各n=8)，在心脏停跳前增加5-HD（100μmol/L）灌注15min其余步骤同P组或D组。
1.2.3 观察指标 (1)复跳时间（TR）：从再灌注开始到心脏恢复第一次机械搏动的时间。(2)血流动力学指标：通过左心耳向左心室内置入充满生理盐水乳胶小囊导管，调节左室舒张末压为0.6～1.0kPa。连接Macintosh微机，以Maclab V/4S生理实验系统实时记录左室功能的变化以及冠脉流量(CF)、心率(HR)。(3)生化指标：实验结束时，取左室心尖部组织，液氮储存，0℃条件下制备组织匀浆，采用硫代巴比妥酸（TBA）法测定心脏组织中MDA含量，以nmol/mgprot表示，采用比色法测定SOD及肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)的活性，以U/mgprot表示。采用高效液相色谱法测定三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）及一磷酸腺苷（AMP）的含量，并计算总腺苷酸（TAN）及细胞能荷(EC)。以μmol/gprot表示心肌腺苷酸含量。
1.3 统计学方法 所有数据均以x±s表示，用SPSS 13.0统计软件对数据进行统计学处理。组内比较采用t检验，不同时间点各组间心功能的比较采用两因素的方差分析，再灌注末各组间的比较采用单因素方差分析，P＜0.05或P＜0.01为差异有显著性或非常显著性。
2 结果
2.1 血流动力学指标 见表1。各组缺血前比较各项心功能指标差异均无显著性。与缺血前比较，P组和D组用药后15min 的HR降低及±dp/dtmax上升明显(P＜0.05，P＜0.01)，再灌注后10min、15min HR、±dp/dtmax、LVDP逐渐恢复同缺血前（P＞0.05），于C组同时间点相比有显著性升高; HP组再灌注后15min HR、±dp/dtmax、LVDP与C组同时间点相比有显著性升高，HP组和HD组再灌注后各时间点较P组和D组HR、LVDP 及±dp/dtmax均明显降低(P<0.05，P<0.01)。
表1 复跳时间及不同时期冠状动脉流量和心功能指标的变化 (略)
2.2 心肌组织MDA的含量和SOD、CK、LDH的活性 见表2。再灌注末P组、D组心肌组织MDA的含量心肌酶明显低于C组（P＜0.01），心肌酶明显低于C组，HP组心肌酶明显低于C组，与P组差异有显著性（P＜0.05），各组SOD活性差异无显著性（P＞0.05）。
表2 生化指标在不同时期的变化 (略)
2.3 心肌组织腺苷酸含量及能荷计算 见表3。再灌注20min后，P组、D组ATP、TAN、EC水平均明显高于C组（P＜0.01），HP组TAN、EC水平均明显高于C组。P组ATP、TAN、EC高于HP组（P＜0.05）。
表3 再灌注20min时心肌组织腺苷酸含量（μmol/g湿重）及能荷变化 （略）
3 讨论
本实验利用mitoKATP通道特异性开放剂Diazoxide和阻断剂5-HD［5］作为工具药观察mitoKATP通道开放对缺血心肌的保护作用。结果表明：在常用的高钾、低温保护措施下，经非选择性KATP通道开放剂Pinacidil 10μmol/L或者mitoKATP通道开放剂Diazoxide 30μmol/L预处理的离体兔心再灌注后心率和血流动力学的恢复明显高于对照组，且接近缺血前水平；脂质过氧化物及心肌酶的含量减少；降低了高能磷酸化合物的代谢，减慢缺血心肌ATP消耗，调整了能量的供需比率，对心肌SOD的活性无明显的影响。KATP通道开放剂对高钾停跳离体兔心缺血再灌注损伤具有确切且相似的保护效果，并且这种保护效果可能与mitoKATP开放有关。本实验还发现预先以mitoKATP通道阻断剂5-HD阻断mitoKATP通道的HP组和HD组心肌组织损伤均重于P组和D组，进一步实验发现HP组再灌注后15min血流动力学恢复及EC水平均明显高于同期C组，心肌酶低于C组，提示阻断mitoKATP通道并不能完全阻断KATP通道开放剂对再灌注损伤的保护作用，除mitoKATP通道的激活外还有其他机制共同参与对再灌注损伤心肌的保护作用。
目前认为有关mitoKATP通道开放后引起心肌保护效应的机制主要与以下几个方面有关：(1)调节自由基的生成。在缺血期缺氧抑制呼吸链时，辅酶Q被还原成半泛醌，后者在缺血再灌注过程中与氧发生反应生成氧自由基，当mito KATP通道开放，激活PKC和P38MAPK通路而触发心肌保护作用［6，7］。而在再灌注期，mitoKATP通道开放线粒体膜电位降低、去极化，线粒体呼吸作用增强，膜电位降低与线粒体呼吸作用增强的“适度去耦联”可以减少氧自由基的产生，该作用也能被5-HD所抑制［8～10］。这与本实验结果一致。(2)减少线粒体Ca2+超载。mitoKATP通道开放使K+内流进入线粒体，降低了跨膜电位差，抑制了Ca2+内流，激活环孢素A敏感性的Ca2+释放，从而有效防止线粒体内的钙超载［11，12］。另一方面，由于进入线粒体的Ca2+减少，引起胞浆内Ca2+浓度增加而诱发保护作用，用PKC 抑制chelerythrine 阻断了二氮嗪的心肌保护作用，使该观点得以证实［13］。（3）线粒体基质肿胀与呼吸链优化。线粒体基质体积对其能量生成的调节有重要作用，体积适当增加(<10%)能激活脂肪酸氧化和电子转移，可增加ATP合成、促进线粒体呼吸［14］。mitoKATP的打开促进了K+内流，使线粒体基质肿胀、容积增加，激活电子传递链，促进线粒体呼吸和增加净氧化，促进能量代谢，ATP合成增加，并导致线粒体部分脱耦联，使ADP被有效的阻挡在线粒体内膜外，迫使线粒体只能磷酸化肌酸，而磷酸化肌酸是线粒体向细胞质传输能量最有效的方式［15］，使氧化磷酸化达到最佳效率，增加ATP合成，提高线粒体功能［16］。KATP通道开放利于阳离子内流和阴离子外流达到平衡使线粒体基质容积达到最佳状态［17］。（4）线粒体膜电位的变化有助于缺血时糖酵解途径向着利于细胞存活的方向转变。
mitoKATP 开放具有心脏保护作用。阐明其作用机制并开发此类药物可能对缺血性心脏病的治疗提供良好的应用前景。
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作者单位： 221002 江苏徐州，徐州医学院附属医院急救中心
(编辑：罗 彬)