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【摘要】 目的 研究银杏黄酮对三氯化铝所致痴呆模型大鼠学习记忆能力和海马内β-APP阳性神经元的影响，以期探讨银杏黄酮抗老年性痴呆的作用机制。方法 用三氯化铝致老年性痴呆模型大鼠为实验对象，以其学习记忆能力、背海马和齿状回内β-APP阳性神经元的数量为指标，全面考察银杏黄酮抗老年性痴呆的作用。结果 银杏黄酮(100、200、400mg/kg，ig)，能明显对抗老年性痴呆模型大鼠学习记忆能力的下降，抑制背海马和齿状回内β-APP阳性神经元的生成。结论 银杏黄酮对三氯化铝所致的老年性痴呆有明显的改善作用 。
【关键词】 银杏黄酮；学习；记忆；小鼠
The effects of Ginkgo flavone on Alzheimer’s model rats induced by AlCl3
DOU Li-hua，MA Yu-kui，DING Yuan-sheng.
Huxia Hospital of Shandong，Jinan 250031，China
【Abstract】 Objective By using Alzheimer’s model rats induced by AlCl3，the effects and mechanism of Ginkgo flavone were investigated.Methods Ginkgo flavone were given to rats by oral for seven weeks.Then，the ability of study of mice were determined by step-down test and the number of neurons in the Bregma hippocampus containing β-APP proteins were counted.Results To the model rats，Ginkgo flavone (100，200，400mg·kg，ig)has protective effects of the impairement of memory of rats and decrease the number of neurons in the Bregma hippocampus containing β-APP proteins.Conclusion Ginkgo flavone has a remarkable improvement of Alzheimer’s model rats induced by AlCl3.
【Key words】 Ginkgo flavone;learning memory;rat
银杏黄酮(Ginkgo flavone)是从中草药银杏叶中提取分离的有效成分。临床及药理研究［1，2］表明，银杏黄酮对老年性痴呆有一定的治疗作用，能对抗老年性痴呆所导致的学习记忆能力的降低，认为作用机制可能是使老年性痴呆病人脑组织中M1受体上调。但老年性痴呆是个综合过程，涉及机体各个系统、不同结构层次的多项指标。本文采用三氯化铝所致的老年性痴呆模型大鼠考察了银杏黄酮的促智及抑制β-APP阳性神经元生成的作用。
1 材料
1.1 动物 Wistar大鼠，雄性，200～220g，上海西普尔-必凯实验动物有限公司，合格证号：SCXK(沪)2003-2002。
1.2 药品与试剂 银杏黄酮：沈阳药科大学植化教研室提供。结晶三氯化铝：沈阳市试剂三厂(批号：20001201)。多聚甲醛：中国医药(集团)上海化学试剂公司(批号：990020)。单克隆抗β-APP：ZYMED公司(批号：20873083)。SA1021-即用型SABC免疫组化染色试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司(批号：200210)。
1.3 仪器 大鼠跳台箱：DBA-2型，医科院药物研究所。OLYMPUSBH-2型光学纤维镜：日本OLYMPUS光学有限公司。Leitzl512型石蜡切片机：德国Leitz公司。LX-1型医用溶蜡箱：天津市三水科学仪器有限公司。
2 方法
2.1 三氯化铝致老年性痴模型的建立［3］ 取健康♂大鼠50只，随机分为5组：正常组、模型组及3个给药组。除正常组外其余各组灌服AlCl3 500mg/(kg·d)，正常组灌服等容积的蒸馏水，第30天时用大鼠避暗法考察痴呆形成程度，待模型形成后，给药组灌服Alcl3的同时给予不同浓度的银杏黄酮，连续75天。第75天开始进行跳台试验，第80天处死大鼠，测定背海马和齿状回内含淀粉样前体蛋白(β-APP)神经元的个数。
2.2 痴呆大鼠学习记忆能力的测定-跳台法［3］ 跳台箱底部为电栅板，箱内有一高10cm的平台。条件刺激为铃声，非条件刺激为足底电击。其程序为铃声5s，继之以电击10s，间隔20s。大鼠受到电击跳上平台称之为被动回避反应；听到铃声而未遭到电击之前跳上平台称之为主动回避反应。每天训练10次，记录主动回避反应的次数。
2.3 大鼠海马中含淀粉样前提蛋白神经元计数法 大鼠以20%乌拉坦麻醉后，打开胸腔，灌流针头自左心室插入主动脉，先以生理盐水冲洗出血液，以输液器注入4%多聚甲醛。固定后立即取出大脑，置4%多聚甲醛中固定1～3h，以70、80、90、95%的乙醇各脱水3h，无水乙醇脱水两次，每次20min，此后以元水乙醇和二甲苯的混合液处理10min，二甲苯4min，进行透明。60℃以下埋入石蜡中。切片，37℃恒温箱中烤片，常规脱腊至水后，以蒸馏水配制的3%H2O2，室温下泡5～10min以灭活内源性酶，再以蒸馏水洗3次。再次切片泡入0.01M的枸橼酸盐缓冲液中，电炉加热至沸腾后断电，间隔5min后，反复2次，冷却后以0.1M的磷酸盐缓冲液洗涤2次。此后滴加正常山羊血清封闭液，室温保持20min。甩去多余液体，滴加一抗(单克隆抗β-APP，1∶100)，4℃过夜。0.1M的磷酸盐缓冲液洗涤3次后，滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，20℃～37℃，30min，0.1M的磷酸盐缓冲液洗涤3次后，用3，3-二氨基苯联胺显色5min，蒸馏水洗涤。最后以苏木素复染30s，脱水，透明，封片。光镜下观察，统计背海马和齿状回内含淀粉样前提蛋白神经元的个数。
2.4 统计学处理 各组数据采用x±s表示，组间比较采用t检验。
3 结果
3.1 Ginkgo flavone对痴呆大鼠学习记忆能力的影响 与正常对照组相比，模型组大鼠的主动回避反应次数在训练的各天没有明显提高；与模型组比较，银杏黄酮高、中、低3个剂量组大鼠的主动回避反应次数在训练的各天均有显著升高。结果表明，三氯化铝可明显损害大鼠的学习记忆过程；银杏黄酮对痴呆模型大鼠的学习记忆障碍有明显的改善作用(表1)。
Tab 1（略）
注：##P＜0.01，compared with normal group;P＜0.05，P＜0.01，compared with model group
3.2 Ginkgo flavone对痴呆大鼠背海马和齿状回内β-APP阳性神经元的作用 与正常对照组相比，模型组大鼠背海马和齿状回内β-APP阳性神经元明显增加。与模型组比较，银杏黄酮高、中、低3个剂量均可使大鼠背海马和齿状回内β-APP阳性神经元明显减少(表2)。
Tab 2（略）
注：＃＃P＜0.05，compared with normal group;P＜0.05，P＜0.01，compared with model group
4 讨论
用慢性铝中毒的方法建立老年学习记忆障碍模型是研究老年性痴呆较为理想的模型之一［4］。国内有学者研究表明，三氯化铝可明显降低大鼠的回避反应率，抑制回避反应的保留。铝可进入脑内取代钙和镁离子，同氨基酸链上的谷氨酸或精氨酸的羧基结合形成谷氨铝盐或精氨酸铝盐的稳定复合物而沉积于脑内，引起双螺旋纤维蛋白异常磷酸化反应，形成神经元缠结，引起A β的形成而产生老年斑，最终导致神经元死亡［5］。而A β是由β-APP产生的，因此，可以通过抑制β-APP的产生而达到治疗老年性痴呆的目的。本研究表明：银杏黄酮可以有效对抗三氯化铝所致的老年性痴呆大鼠学习记忆能力的降低，具有明显的促智作用；可明显减少痴呆大鼠背海马和齿状回内β-APP阳性神经元的个数，对海马神经元有一定的保护作用，但其确切的机制有待于进一步研究。
【参考文献】
1 胡雅儿，易宁育，夏宗勤，等.老年大鼠脑M受体亚型的变化及知母的调整作用.中药药理与临床，1993，9(1)：15-18.
2 范国煌，易宁育，夏宗勤.知母皂苷元对原代培养的神经细胞M受体密度和代谢动力学的影响.中国中医基础医学杂志，1997，3(6)：15-17.
3 胡海涛，钱亦华，杨杰，等.淀粉样前提蛋白在痴呆模型大鼠背海马结构内的表达.解剖学杂志，1997，20(5)：444-446.
4 吴正冶.Alzheimer’s病病因病理研究进展.深圳中西医结合杂志，1997，(7)：35-38.
5 陈诒.老年性痴呆的神经病理.实用老年医学，1990，4(3)：128-129.
(编辑：罗 彬)
作者单位： 250031 山东济南，济南华夏医院
250100 山东济南，山东省医药工业研究所