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Home医源资料库在线期刊中华医药杂志2005年第5卷第12期

从NO、ET角度探讨丹参素抗急性重型肝损伤的机制

来源:中华医药杂志
摘要:【摘要】目的从血管活性物质一氧化氮(NO)、内皮素(ET)探讨丹参素(DSS)抗急性重型肝损伤的机制。方法用硫代乙酰胺(TAA)构建急性重型肝损伤大鼠模型。26只雄性Wistar大鼠分为3组:正常对照组(N组),TAA组,TAA+DSS组。采用生化检测方法、免疫组化染色法和光镜技术,检测实验各组血浆内毒素、丙氨酸转氨酶(ALT)、NO和......

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  【摘要】  目的  从血管活性物质一氧化氮(NO)、内皮素(ET)探讨丹参素(DSS)抗急性重型肝损伤的机制。方法  用硫代乙酰胺(TAA)构建急性重型肝损伤大鼠模型。26只雄性Wistar大鼠分为3组:正常对照组(N组),TAA组,TAA+DSS组。采用生化检测方法、免疫组化染色法和光镜技术,检测实验各组血浆内毒素、丙氨酸转氨酶(ALT)、NO和ET水平的变化、结构型一氧化氮合酶(eNOS)和诱生型一氧化氮合酶(iNOS)在肝组织中的表达变化及肝组织形态学改变。结果  TAA组血浆内毒素、ALT、NO、ET水平明显高于N组(P<0.05);TAA+DSS组与TAA组相比,内毒素、ALT、NO和ET显著降低(P<0.05)。免疫组化染色TAA+DSS组iNOS表达较TAA组明显减少(P<0.05);TAA+DSS组与N组比较eNOS表达明显增多(P<0.01)。Weigert染色显示TAA组微血栓计数明显增加,TAA+DSS组较前明显减少(P<0.01)。结论  丹参素通过降低ET含量,上调eNOS表达、下调iNOS的表达调节NO含量,改善肝脏微循环障碍,从而减轻急性重型肝损伤。
   
  【关键词】  肝损伤;丹参素;微循环;一氧化氮;内皮素
  
  Protection by danshensu in liver injury rats and its mechanism relating to nitric oxide and endothelin

  ZHOU Xin, HAN De-wu, YIN Lei, et al.

  Department of  Pathophysiology ,Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

  【Abstract】  Objective  To explore protective effects of Danshensu(DSS) in severe hepatic injury rats and its mechanism relating to endothelin and nitric oxide. Methods   Acute liver injury was induced by intragastric thioacetamide(TAA). The rats were randomly divided into 3 groups, namely:normal control group(N), TAA treated group(TAA), TAA and DSS treated group(TAA+DSS). The changes of plasma biochemistry and immunohistochemistry and hepatic histopathology were measured.Results  The levels of ALT、endotoxin、NO and ET in TAA+DSS group significantly decreased(vs TAA group, P<0.05).Immunohistochemical staining showed: eNOS expressial up regulation in TAA+DSS group compared with N group (P<0.05); nevertheless iNOS expressial up regulation in TAA group compared with TAA+DSS group (P<0.05). Weigert’s staining showed microthrombi in TAA+DSS group significantly reduced (vs TAA group,P>0.05).Conclusion  Danshensu protect the severe hepatic injury by the decreasing of the value of ET and the up regulation of the hepatic eNOS expression and down regulation of the hepatic iNOS expression, the improvement of hepatic microcirculation.

  【Key words】  liver injury;danshensu;microcirculation;nitric oxide;endothelin

  丹参为唇形科植物丹参的根,是传统的活血化瘀中药之一。丹参素-D(+)β-(3,4-二羟基苯基)乳酸[1]是丹参水溶性各种成分的基本结构成分,已被证明有抗氧化、抗纤维化等作用[2,3],但其对急性重型肝损伤有否作用,其机制如何尚鲜见报道。为此,笔者从血管活性物质一氧化氮、内皮素的角度探讨丹参素对肝脏微循环的影响,以观察其抗急性重型肝损伤的机制,为临床应用提供实验依据。

  1  材料与方法

  1.1  模型制作及分组  采用灌胃硫代乙酰胺(TAA)的方法复制急性重型肝损伤动物模型。Wistar大鼠硫代乙酰胺(TAA)250mg/kg灌胃,连续2天,第2次灌胃24h后造成急性重型肝损伤。将Wistar大鼠26只随机分为3组:正常对照组(N组);急性肝损伤组(TAA组);急性肝损伤+丹参素灌胃组(TAA+DSS组)。TAA+DSS组给予丹参素(本校药学院赵正保教授提供)7.2mg/kg连续灌胃4天,实验第3天起,除正常组按250mg/(kg·d)给动物生理盐水灌胃外,其余2组按250mg/(kg·d)给动物TAA灌胃,连续2天。所有动物于末次灌胃TAA 24h后,用1%戊巴比妥钠0.33ml/100g腹腔内注射麻醉,在无菌条件下腹主动脉采血,用于生化指标检测。取1/2肝左叶于10%中性福尔马林中固定,石蜡包埋,切片,做Weigert染色和免疫组化染色;1/2肝右叶分别用生理盐水制成10%、20%肝匀浆进行ET和NO的检测。

  1.2  生化指标检测

  1.2.1  丙氨酸转氨酶(ALT)含量测定  采用改良赖氏法。

  1.2.2  血浆内毒素(Endotoxin)测定  鲎试剂法,试剂盒购自上海伊华临床医学科技公司。

  1.2.3  肝组织匀浆ET水平检测  采用放免法,在SN-695A型智能放免γ测量仪进行测定,试剂盒购自北京解放军总医院科技开发中心放免所。

  1.2.4  肝组织匀浆中NO含量测定  硝酸还原酶法,试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

  1.3  病理组织学观察  Weigert改良革兰特殊染色:取大鼠肝左叶固定于纯酒精中,石蜡包埋,4μm切片,做光镜观察,镜下可见经Weigert改良法特染的血管内微血栓呈紫蓝色丝状团块物,每组各取5张切片,每张切片各随机取5个非重叠视野,光镜下(×200)进行微血栓的计数。

  1.4  iNOS和eNOS免疫组化染色  采用SP法,切片脱蜡水化,3%H2O2处理15min,胰酶消化10min,热抗原修复10min,山羊血清封闭,分别滴加1:200eNOS一抗和1:100iNOS一抗(eNOS及iNOS多克隆抗体均由美国Santa Cruz公司提供),4℃过夜,滴加二抗(中山生物技术有限公司)37℃孵育10min,DAB显色,阴性对照以PBS代替一抗。采用Olympus-BH2显微系统摄像,成都泰盟BI2000医学图像分析系统测定阳性细胞所占的面积。

  1.5  统计学分析  采用SPSS10.0统计软件进行处理,采用方差分析、t检验,所有数据均以均数±标准差(x±s)表示。

  2  结果

  2.1  血浆ALT及内毒素水平变化  TAA组与N组相比,ALT及内毒素水平显著升高(P<0.01);TAA+DSS组与TAA组相比,上述指标明显下降(P<0.01),见表1。

  表1  各组动物血浆ALT及内毒素水平变化  (略)

  注:a. vs N组,b. vs TAA组,P<0.01

  2.2  肝组织匀浆ET和NO的变化  TAA组与N组相比,ET、NO均明显升高;TAA+DSS组与TAA组相比,ET、NO均明显下降,见表2。

  表2  肝组织匀浆ET、NO的变化 (略)

  注:a. vs N组, b. vs TAA组,△P<0.05,P<0.01

  2.3  丹参素对肝组织eNOS和iNOS表达的影响  TAA组大鼠肝细胞、枯否细胞胞浆内大量iNOS染色阳性棕黄色颗粒,且TAA组iNOS表达面积明显高于TAA+DSS组(P<0.05),N组未见iNOS表达;TAA+DSS组大鼠肝细胞、肝窦内皮细胞胞浆内有大量eNOS染色阳性棕黄色颗粒,且高于N组eNOS表达(P<0.05),TAA组未见eNOS表达(见图1~4)。

  表3  eNOS和iNOS免疫组化染色半定量分析 (略)

  注:a. vs N组 ,b. vs TAA组,△P<0.05,*P<0.01

  2.4  形态学观察  Weigert氏染色结果显示TAA组与N组相比微血栓计数明显增多(P<0.01);TAA+DSS组与TAA组相比微血栓数明显减少(P<0.01),见表4。

  表4  各组动物肝脏微血管内微血栓计数 (略)

  注:a. vs N组,b. vs TAA组,P<0.01

  3  讨论

  多种肝炎、肝病,特别是严重肝病的情况下,往往出现肠源性内毒素血症。内毒素主要通过激活枯否细胞释放多种血管活性物质引起肝内微循环障碍,导致组织缺血、缺氧从而导致急性重型肝损伤的发生。

  NO和ET作为相互拮抗的一对血管活性物质,在肝脏微循环的调节中具有重要作用。ET是目前已知的缩血管活性最强的多肽类物质[4],可直接作用于肝内微血管,使其收缩导致肝微循环障碍;可作用于肝窦内皮细胞,使其上的“筛孔”孔径变小减少肝窦血流;还可作用于贮脂细胞使Ca2+增多导致其收缩,从而使肝窦直径变小变窄,致肝血流减少。本实验观察到给予丹参素治疗后肝组织ET含量明显减轻,提示丹参素可通过降低ET含量减轻肝脏血管收缩,改善肝脏血液灌注。

  NO在肝脏具有保护和损害双重效应[5],目前认为与NO的来源有关。一般认为内皮型一氧化氮合酶(eNOS)催化产生的NO主要通过:(1)松弛血管平滑肌,同时拮抗缩血管因子TXA2、ET等,维持血液中舒-缩血管因子平衡;(2)抑制血小板聚集对肝损伤起保护作用。而诱生型一氧化氮合酶(iNOS)可产生过量的NO,主要通过[6,7]:(1)参与氧化损伤;(2)干扰细胞代谢,影响细胞功能;(3)导致核酸的亚硝酸化及DNA链降解,从而可介导肝细胞凋亡和直接引起肝细胞死亡,产生肝损害。本实验中TAA导致急性重型肝损伤后,肝组织iNOS表达增加,eNOS表达减少,同时伴NO含量明显增高,组织学可见肝微血管内血栓数明显增多,进一步说明造成肝内微循环障碍的主要是eNOS诱生的NO不足。因此,促进肝组织eNOS的表达所生成的生理性NO是改善肝微循环障碍的关键所在。由于iNOS催化产生的大量NO可通过负反馈调节机制抑制eNOS的表达[8],故抑制iNOS的表达、减少其产生NO亦可作为促进eNOS表达的有效途径之一。本实验显示丹参素可通过抑制iNOS表达减少毒性作用NO产生,而促进eNOS表达诱生的NO发挥了改善微循环、抑制血小板聚集等保护作用,同时又减少ET的产生,调节血管活性物质ET、NO平衡,从而改善受损肝脏微循环。本实验应用现代医学阐述了丹参素的“活血化瘀”作用。

  (本文图片见封三) (略)

  【参考文献】

  1  张德成,吴伟良,刘星增,等.丹参水溶性有效成分的研究.中成药研究,1982,(1):24-25.

  2  蒋莉,李跃华,戚晓红.丹参素对内毒素性肝损伤的防护作用及其机制研究.中西医结合肝病杂志,1999,9(2):30-32.

  3  郑元义,戴立里,王文兵,等.丹参素治疗肝纤维化及其作用机制研究. 中华肝脏病杂志,2003,11(5):288-290.

  4  Mallat A,Lotersztajn S.Multiple hepatic functions of endothelin:physiopathological relevanc.J Hepatol,1996,25(3):405-413.

  5  滕书玲,习玲,武希润.大鼠急性肝损伤中一氧化氮及自由基的变化.中华肝脏病杂志,1998,6(2):113-117.

  6  Curran RD,Billiar TR,Stuehr DJ,et al.Multiple cytokines are required to induce hepatocyte nitric oxide production and inhibit total protein synthesis.Ann Surg,1990,212(4): 462-469.

  7  张光伟,范玉颖,包延军,等. 一氧化氮与肝损伤的研究. 解剖科学进展,2002,8(1):75-77.

  8  Reiner Wiest,Roberto J, Groszmann.The paradox of nitric oxide in cirrhosis and portal Hypertension: too much, not enough.Hepatology,2002,35(2):478-493.

  (编辑:石  岚)

  作者单位: 030001 山西太原,山西医科大学病理生理学教研室

           内蒙古呼和浩特,内蒙古医学院附属医院感染科

 

作者: 周鑫,韩德五,尹镭,赵海珍 2006-8-19
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