三波长法测定银杏叶中总黄酮的含量

    【摘要】  目的  利用三波长分光光度法测定银杏叶中总黄酮含量，并对4种不同溶剂超声提取银杏叶总黄酮的方法进行了比较研究。方法  采用溶剂浸提同时辅以超声波处理的方法提取银杏叶总黄酮，根据AlCl3与黄酮类物质生成黄色化合物的反应原理，利用三波长法测定银杏叶总黄酮的含量。结果  相同条件下甲醇、乙醇、丙酮和水的提取效率分别为0.22639%、0.24454%、0.24949%和0.18972%。黄酮显色液在1h内稳定性为98.673%～100.50%，加样回收率为107.65%～110.06%，RSD小于0.3％。结论  本方法简单、有效、可行，可用于银杏叶中黄酮含量的测定。

　　【关键词】  银杏叶；黄酮；三波长法

　　Determination of total flavonoids in ginkgo biloba leaves by three wavelength spectrophotometry

　　ZHANG Jin-feng，YANG Gui-wen，ZHANG Feng，et al.

　　College of Life Science，Shandong Normal University，Jinan  250014，China

　　【Abstract】  Objective  We determined the total flavonoids extracted from ginkgo biloba leaves by three wavelength spectrophotometry and compared the methods of four different solvents combined with ultrasonic wave treatment.Methods  Total flavonoids were extracted from ginkgo biloba leaves by four solvents with ultrasonic wave treatment. Based on the reaction of flavonoids with AlCl3 to produce stable complex，we determined the flavoniods by three wavelength spectrophotometry.Results  The extracting efficiencies of methanol，ethanol，acetone and water are 0.22639%，0.24454%，0.24949%，0.18972%，respectively. Moreover，the stability of the flavoniods is 98.673%～100.50%，the recovery is 107.65%～110.06% and RSD is less than 0.3%.Conclusion  The accuracy of this method is more advantageous than tranditional spectrophotometry method.

　　【Key words】  ginkgo biloba leaves;flavonoids; three wavelength spectrophotometry

    银杏(Ginkgo biloba)叶中含有多种化学成分，黄酮类化合物和银杏萜内酯［1］是其主要生理活性成分之一。目前银杏叶黄酮类化合物含量的测定常用分光光度法［2］、荧光光度法［3］和高效液相色谱法［4］等。用分光光度法进行测定时，由于样品中含有大量原花色素、叶绿素等干扰因素，准确度较低。荧光光度法和高效液相色谱法，准确度虽高，但需要昂贵的仪器设备。而三波长法扣除原花色素、叶绿素等干扰造成的吸收峰不对称给定量分析带来的影响［5～7］，同时又具有简便易做的优点，已为越来越多的实验室所采用。本实验采用溶剂浸提同时辅以超声波处理的方法提取银杏叶总黄酮，利用AlCl3与黄酮类物质生成黄色化合物的显色反应，以三波长法测定银杏叶总黄酮的含量，测定结果显示本方法简单、有效、可行，可用于银杏叶中黄酮含量的测定。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料与仪器 

　　(1)银杏叶（购于济南建联中药店）；芦丁标准品（纯度98%，购于山东省质量监督检验所）。(2)高速万能粉碎机（黄骅卸甲综合电器厂）；超速离心粉碎机（日本）；KQ-100DB型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；旋转蒸发仪（德国）；高速冷冻离心机（德国）；DU-640核酸蛋白分析仪（美国）。

　　1.2  银杏叶总黄酮的提取 

　　干燥的银杏叶用超速离心粉碎机和高速万能粉碎机粉碎，得到银杏叶磨粉，于常温干燥箱中保存。

　　分别称取1.0g银杏叶磨粉，加入70%甲醇、70%乙醇、70%丙酮和水（3次，分别为40、30、10ml），40℃、70%功率超声处理3次（时间分别为40、30、20min），室温8000rpm离心15min，合并3次上清，用旋转蒸发仪进行减压蒸馏（50℃），直至残留少数水分，所提物质变为膏状。用dH2O重新溶解并过滤定容至100ml。

　　1.3  芦丁三波长的确定和标准曲线的绘制 

　　准确称取2.50mg芦丁标准品，加dH2O超声溶解并定容至25ml，浓度为0.1mg/ml。取0.5ml芦丁标准液，用1%AlCl3定容至5ml，在160～660nm进行全波长扫描得到吸收曲线，由此确定3个波长。

　　分别吸取0.1mg/ml芦丁标准液0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml于2ml容量瓶中，用dH2O定容至刻度并混匀。准确吸取上述各浓度溶液0.5ml，用1%的AlCl3定容至5ml，所得溶液的终浓度分别为0.001、0.002、0.004、0.006、0.008、0.01mg/ml，在选定的3个波长下测定光吸收值，根据文献5和7的方法绘制标准曲线并计算回归方程。

　　1.4  银杏叶总黄酮含量的测定 

　　吸取各银杏叶总黄酮提取液0.5ml，加入AlCl3定容至5ml，测定3个波长处的光吸收值，计算1g银杏叶中提取的总黄酮的含量及百分比，重复5次。

　　1.5  稳定性试验 

　　根据上述实验方法1h后测定黄酮显色液的光吸收值，计算各显色液的稳定性。稳定性＝1h后测定的黄酮含量/原银杏叶总黄酮含量×100%

　　1.6  回收率及精密度试验 

　　取各黄酮提取液0.5ml，加入一定量的芦丁标准液，按上述条件测定光吸收。计算平均回收率及RSD。回收率=实测值/理论值×100%

　　2  结果与讨论

　　2.1  芦丁三波长的确定和标准曲线 

　　芦丁在160～660nm之间主要有两个吸收峰1和2，而所提的银杏叶总黄酮在这2个吸收峰处都有光吸收。考虑到总黄酮中原花青素、叶绿素等色素及氨基酸、生物碱等化合物在2个峰处均有吸收，对黄酮的测定会产生一定的影响，选定370、420、470nm作为最佳3个波长来进行测定。见表1。表1  芦丁标准液浓度与Δ A之间的关系（略）

　　说明黄酮浓度在0.001～0.01mg/ml范围内，分别在370、420、470nm处测吸光值时，△A与浓度C之间呈良好的线性关系

　　2.2  不同溶剂提取银杏叶总黄酮含量的比较 

　　由表2可以看出，不同的溶剂对银杏叶中总黄酮的提取效率有所不同，其中丙酮的提取效率最高为0.24949%，其次为乙醇0.24454%、甲醇0.22639%，分别比水的提取效率高31.50%、28.90%、19.33%。3种有机溶剂与水所提的黄酮含量之间的差异均达到显著水平(n=5，P＜0.05)。表2  三波长法测定不同溶剂提取的银杏叶总黄酮含量比较（略）注：与水提的黄酮含量相比，*P＜0.05

　　2.3  稳定性结果  见表3。表3  1h后银杏叶总黄酮含量的稳定性（略）

    由表3可以看出，不同溶剂提取的银杏叶总黄酮显色液在1h内的稳定性为98.673%～100.50%，说明在显色1h内黄酮含量较稳定。

　　2.4  回收率及精密度结果 

　　见表4。表4  不同溶剂提取的银杏叶总黄酮的回收率（略）

    由表4可以看出，各种黄酮提取液的回收率在107.65%～110.06%之间，RSD值小于0.3%，说明此方法回收率较好而且精密度较高。为银杏中黄酮含量的测定提供了更准确可行的方法。

　　【参考文献】

　　1  van Beek TA. Chemical analysis of Ginkgo biloba leaves and extracts.J Chromatogr A，2002，967(1)：21-55.

　　2  邓桂春，王鑫，赵丽艳，等.分光光度法测定银杏叶中黄酮的含量.辽宁大学学报(自然科学版)，2005，32(2)：101-104.

　　3  张敏，曹庸，唐纯翼，等.Al3+-芦丁二元络合物荧光光度法测定银杏叶中总黄酮的含量.分析科学学报，2005，21(2)：188-190.

　　4  Gray D，LeVanseler K，Pan M. Determination of flavonol aglycones in Ginkgo biloba dietary supplement crude materials and finished products by high-performance liquid chromatography：single laboratory validation. J AOAC Int，2005，88(3)：692-702.

　　5  回瑞华，侯冬岩，关崇新，等.三波长分光光度法测定红茶及其饮料中黄酮的含量.食品科技，2004，(5)：67-72.

　　6  董怀海，谷文英. 三波长比色法测定大豆异黄酮的研究.中国油脂，2002，27(4)：75-77.

　　7  侯冬岩，回瑞华，杨梅，等.苦丁茶中总黄酮的三波长-光谱法定量分析.分析化学，2004，32(6)：783-786.

　　作者单位： 250014 山东济南，山东师范大学生命科学学院（△通讯作者）

　　(编辑：罗彬)