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【摘要】 目的 探讨端粒酶作为一种新的生物学标志物用于常见胸部恶性肿瘤诊断和预后评价等方面的临床应用价值。方法 采用端粒重复序列扩增法对原发性肺癌、食管癌手术切除组织及相应的癌旁组织进行端粒酶活性分析，并以相应的良性病变作为对照。结果 32例肺癌组织中端粒酶阳性率为84.4%，癌旁组织为9.4%，在良性组织中未检出端粒酶阳性。端粒酶活性随肺癌临床分期有升高趋势，伴淋巴结转移标本组中其阳性率明显高于非淋巴结转移组(P＜0.05)，但与肿瘤病理组织学类型、分化程度等差异无显著性(P＞0.05)。37例食管癌端粒酶阳性率为89.12%，癌旁组织为18.92%，正常食管组织未检出端粒酶阳性。当癌侵及肌层及外侵后，其阳性表达率高于局限于黏膜及黏膜下层者，差异有显著性(P＜0.01)。伴淋巴结转移标本中其阳性率高于非淋巴结转移者(P＜0.05)。结论 端粒酶有可能成为肺癌、食管癌早期诊断和判断预后的重要生物标志物和治疗新靶点。
【关键词】 肺肿瘤；食管肿瘤；病理学；端粒酶；诊断；生物治疗
Telomerase activity in common thoracic malignant tumors
SHI Hong-can，SHI Wei-ping，SHU Yu-sheng，et al.
Yangzhou University College of Clinical Medicine，Yangzhou 225001，China
【Abstract】 Objective To investigate the correlation between the expression of telomerase activity and the clinicopathological characteristics of common thoracic malignant tumors.Methods Lung and esophageal carcinomas and corresponding tissues adjacent to carcinomas were obtained from 69 surgically treated，and benign tissues were used to be controls.The PCR-based telomeric repeat amplification protocal-enzyme linked immunosorbent assay was conducted for detection of telomerase activity in these samples.Results Telomerase activity was detected in 27(84.4%)of 32 lung carcinomatous tissues，and only 3 (9.4%) of the 32 adjacent noncancerous tissue samples but in none of the 7 specimens of the lung benign lesions，P＜0.05.Correlation with pathological parameters showed that the expression of telomerase activity was associated with lymph nodes metastasis，P＜0.05. The telomerase activity was detected in 32(89.12%) of 37 esophageal carcinomatous tissues，in 7(18.92%) of 37 tumor-adjacent tissues and in none in normal esophageal epithelium，P＜0.05. Higher activity of telomerase was more frequently detected in infiltrating or metastatic late-stage tumors than in non-infiltrating or non-metastatic tumors，P＜0.05.Conclusion Telomerase may be regarded as one of the diagnostic and prognostic biomarker in lung carcinoma and esophageal carcinoma，and may become a novel target for the treatment of these diseases.
【Key words】 lung neoplasms ;esophageal neoplasms；pathology; diagnosis; telomerase；biological therapy
端粒酶的激活是细胞永生化或恶化的共同通路，是肿瘤细胞增殖、癌症得以进展的重要机制。检测癌组织、癌前病变或肿瘤良性生长阶段的端粒酶活性可预测肿瘤发展情况并对诊断有重要参考价值［1］。笔者应用端粒重复序列扩增法对常见胸部恶性肿瘤—原发性肺癌和食管癌组织中端粒酶表达状况进行了检测，旨在研究端粒酶是否参与了肺癌、食管癌的发生、发展进程以及它的活性表达与肿瘤临床生物学行为的关系，为临床早期诊断以及合理地开展以端粒酶为新靶点的生物学治疗提供理论依据和可行性。
1 材料与方法
1.1 标本来源
收集本院胸外科1999年6月～2000年8月间原发性肺癌32例、食管癌37例手术切除组织标本。手术标本离体后，剔除出血、坏死组织，切取等量癌组织、癌旁组织(距癌缘5cm处)，液氮冻存标本。69例患者中男49例，女20例；平均年龄53岁。术前均未使用化疗、放疗及免疫学治疗。32例肺癌标本中鳞癌16例，腺癌11例，小细胞癌2例，类癌1例，恶性母细胞瘤1例，支气管黏液表皮样癌1例。肺良性病变7例，其中炎性假瘤4例，硬化性血管瘤2例，结核球1例。37例食管癌均为鳞状上皮细胞癌。6例正常食管组织为非癌病人内镜活检标本。所有标本均经术后病理组织学证实。
1.2 端粒酶活性检测
端粒酶活性试剂盒(TRAP-Hyb kit)由华美生物工程公司提供。取冻存的组织标本30mg匀浆，加入1mlPBS缓冲液，混匀后冰浴3min，取300μl上清液置0.5ml离心管中，15000r/min离心20s收集细胞，加入50μl细胞裂解液，混匀后冰浴裂解30min，于4℃14000r/min离心20min后取上清液2μl，加入45μl反应混合物混匀，加入30μl石蜡油，置25℃水浴保温30min，按如下条件进行PCR循环：94℃ 120s，94℃ 30s，48℃ 30s，72℃ 90s，72℃ 300s，循环35个周期。在微孔板各孔中加入杂交反应液，再加入扩增产物25μl混匀，设立阴阳及空白对照。置37℃恒温反应60min，然后加入显色剂，37℃避光显色10min，加入终止液，终止反应。Bio-Rad Model 500型酶标仪测其在波长450nm的吸光度值(A)，样本A值≥阴性对照A值的2.1倍时，判为端粒酶活性阳性。
1.3 统计学处理
数据资料采用χ2检验。
2 结果
2.1 端粒酶活性在原发性肺癌组织中的表达状况
32例肺癌组织中端粒酶活性阳性表达率为84.4%(27/32)，相应的癌旁组织阳性率仅为9.4%(3/32)，两者比较差异有显著性(P＜0.05)。7例肺良性病变组织中端粒酶表达均阴性，与肺癌组比较，差异具有非常显著性(P＜0.001)。细胞分化程度由高度、中度到低度分化，端粒酶阳性率分别为80％（8/10）、83.3％(15/18)和100％(4/4)，三者之间差异无显著性(P＞0.05)。伴淋巴结转移组其端粒酶活性阳性检出率为94.7%(18/19)明显高于无淋巴结转移组69.2%(9/13)，二者比较差异有显著性(P＜0.05)。
2.2 端粒酶活性在食管癌组织中的表达状况
37例食管鳞癌组织标本中，32例端粒酶活性呈阳性，阳性率为89.12%，相应的癌旁组织中有7例阳性，阳性率为18.92%，二者比较差异有非常显著性(P＜0.001)。6例正常人食管组织端粒活性均阴性，与食管癌组比较，差异亦具有非常显著性(P＜0.001)。当癌侵及肌层及外侵后，其阳性表达率100％（23/23）高于局限于黏膜及黏膜下层者71.42%(10/14)，差异有显著性(P＜0.01)。21例伴有淋巴结转移的标本中端粒酶活性阳性率达100%，而在16例无淋巴结转移的标本中端粒酶活性阳性率为75%(12/16)，二者比较差异有显著性(P＜0.05)。随着细胞分化程度由高度、中度到低度分化，其阳性率分别为81.82％（9/11）、88.89％（16/18）和100％（8/8），三者之间差异无显著性(P＞0.05)。端粒酶活性与病理类型、肿瘤部位(上、中、下段食管)、肿瘤大小(<3cm，3～5cm，>5cm)均未显示相关性(P＞0.05)。
3 讨论
人体存在着许多抑制细胞无限增殖的复杂机制，其中之一就是伴随着每次细胞分裂而发生的染色体末端序列－端粒的进行性缩短。端粒酶则以自身RNA为模板逆转录出一段DNA以延长端粒并维持其稳定性。端粒酶活性与肿瘤细胞恶性程度有关。本试验对临床常见的胸部恶性肿瘤原发性肺癌和食管癌组织中的端粒酶活性表达状况进行了检测，结果显示，32例肺癌组织中端粒酶活性表达阳性率为84.4%，7例肺良性病变组织中端粒酶表达均阴性。37例食管癌组织中端粒酶阳性者32例，阳性表达率为89.12%，6例正常食管上皮组织其端粒酶活性均为阴性。结果表明，端粒酶在肺、食管正常组织中失活，而在肺、食管黏膜上皮癌变与肿瘤的形成过程中发挥重要作用。端粒酶可望成为肺癌、食管癌诊断和与良性病变进行鉴别诊断的有力生物学标志物。据此，笔者认为，对怀疑肺癌、食管癌的患者做内镜检查或细胞学普查时，可常规对活检组织及脱落细胞进行端粒酶活性检测，以期早期发现癌变。
端粒酶活性的调节机制复杂，目前尚存在争论。本试验结果提示，尚有少数癌组织未能表达端粒酶活性，分析可能与细胞内存在一些非端粒酶依赖性端粒维持方式或端粒酶还受其他因子调控有关［2］。肿瘤组织中的濒死性细胞端粒酶活性不表达，而如果肿瘤组织中濒死性细胞比率较增殖细胞高，则端粒酶活性表达为阴性，端粒酶活性在某些肿瘤组织中的低表达和不表达可能是由于那些濒死性细胞存在的结果。Yashima［3］认为癌旁组织的重度炎症或癌前病变也能使端粒酶活性呈阳性表达。本组资料进一步显示，肺癌旁组织端粒酶阳性率为9.4%，而食管癌相应的癌旁组织阳性率达18.92%，说明这些部位可能存在肿瘤微转移病灶或多源癌灶，而这种变化往往不被常规病理检查所发现，这一点在决策手术方式时应予充分考虑。笔者认为，除了遵循规范化手术操作外，如有条件应对癌旁组织常规进行端粒酶活性监测，则有助于确认手术切缘异常的“分子边界”，对准确判断手术切除范围、预测手术效果和局部复发有重大意义，并能为对术后仍处于亚临床状态的患者实施有效的辅助性治疗提供分子生物学依据。
Counter等［4］研究发现，虽然端粒酶活性不是引起细胞癌变的初始因素，但却是一个维持肿瘤生长的继发性改变，即端粒酶活性表达是恶性肿瘤发生的后续事件。Durdux等［5］研究则表明，端粒酶活性的强弱很可能是影响病人预后的一个重要因素。笔者的研究资料提示，端粒酶的激活与恶性肿瘤细胞分化程度和有无淋巴结转移密切相关，同时也与食管癌细胞侵袭食管壁的程度有关。初步表明，端粒酶表达水平的高低可能与肺癌、食管癌的恶性进展和转移潜能有关。因此，端粒酶活性检测有可能成为判断预后的重要指标。
由于端粒酶的激活在恶性肿瘤形成进程中发挥重要作用，因此通过某种手段抑制端粒酶活性就有可能导致端粒继续缩短，最终使细胞死亡，从而达到治疗恶性肿瘤的目的。肿瘤治疗的理想靶点是肿瘤生长所必需，而不存在于正常细胞的细胞成分。端粒酶活性与恶性肿瘤的高度相关性使之成为目前肿瘤治疗的新热点。采用反义核苷酸、核酶、蛋白激酶抑制剂、细胞分化诱导剂作为端粒酶抑制剂正引起了人们的广泛关注［6～8］。恶性肿瘤细胞的侵袭与转移是肺癌、食管癌术后复发和放化疗失败的主要原因，也是患者治愈率远不能提高的主要影响因素。肺癌、食管癌组织中端粒酶活性有较高的表达，为肺癌、食管癌术后选择以端粒酶为靶点实施生物学治疗提供了有价值的实验依据和可行性。笔者期望对端粒酶与肺癌、食管癌的关系以及端粒酶抑制剂在体内外对癌细胞的影响做深入研究，这对揭示肺癌、食管癌发生与发展机制，寻找抗肿瘤治疗新途径具有重要的临床价值。
【参考文献】
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4 Counter CM，Gupta J，Harley CB，et al. Telomerase activity in normal leukocytes and in hematologic malignancies. Blood，1995，85(9)：2315-2320.
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8 Granger MP，Wright WE，Shay JW.Telomerase in cancer and aging.CritRev Oncol Hematol，2002，41(1)：29-40.
基金项目：扬州大学科研基金资助项目(编号：K0111231)
作者单位： 225001 江苏扬州，扬州大学临床医学院胸心外科
(编辑：邓锋)