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2-甲氧雌二醇作用机制研究进展

来源:中华医药杂志
摘要:【摘要】2-甲氧雌二醇作为雌二醇代谢产物,具有抑制肿瘤生长和转移的作用。由于该药只对增殖活跃的细胞有作用,而对静止细胞无作用,因而不良反应较小,故近年来日益受到重视,细胞周期停滞、诱导细胞凋亡及抑制血管新生是其抗肿瘤作用的主要机制。目前2-甲氧雌二醇已进入临床Ⅱ期试验阶段,并显示出了良好的应用前景。......

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    【摘要】  2-甲氧雌二醇作为雌二醇代谢产物,具有抑制肿瘤生长和转移的作用。由于该药只对增殖活跃的细胞有作用,而对静止细胞无作用,因而不良反应较小,故近年来日益受到重视,细胞周期停滞、诱导细胞凋亡及抑制血管新生是其抗肿瘤作用的主要机制。目前2-甲氧雌二醇已进入临床Ⅱ期试验阶段,并显示出了良好的应用前景。

    【关键词】  2-甲氧雌二醇;细胞周期停滞;细胞凋亡;血管新生

    2-甲氧雌二醇(2-methoxyestradiol)为雌二醇的代谢产物,由雌二醇2位碳原子先羟化再甲基化形成。化学名为17β-2-甲氧基雌-1,3,5(10)-三烯-3,17-二醇。因可以抑制血管新生,且不良反应较小,而广泛用于肿瘤的治疗,目前处于临床II期研究中。研究表明2-甲氧雌二醇对雌激素受体的亲和力较低,而且雌激素受体激动剂和拮抗剂对其作用也没有影响,表明2-甲氧雌二醇似乎并不是通过影响雌激素受体通路而起作用[1]。

    1  药理作用特点

  近年来认为,2-甲氧雌二醇具有抗肿瘤的作用,且治疗耐受性较好。Cushman M等[2]报道2-甲氧雌二醇对55种不同肿瘤细胞株有抑制作用。在一项多中心、随机、双盲的II期临床试验[3]中,33名雄激素抵抗型前列腺癌患者随机给予400mg/d,1200mg/d的2-甲氧雌二醇,发现400mg/d剂量组患者在用药第1天和第28天的血药浓度峰值(Cmax)分别为2.2 ng/ml,5.5ng/ml,1200mg/d剂量组则分别为2.6 ng/ml,9.6ng/ml。两个剂量组之间的生物利用度没有显著差异,表明该药吸收有限。2-甲氧雌二醇治疗后,患者的前列腺特异抗原(PSA) 水平稳定和降低;血管内皮生长因子(VEGF)及成纤维细胞生长因子(bFGF)的水平在用药1个月时较用药前下降40%,而用药3个月时,则较用药1个月再下降55%。研究表明80%~95%的2-甲氧雌二醇在17位氧化,该代谢产物的活性不及原型药物的1/10。在33名患者中有3人出现AST和ALT水平的升高(2或3级肝功能异常),但停药后迅速回复到正常水平,且血浆2-甲氧雌二醇浓度和肝功能异常之间没有相关性,患者亦未出现4级肝功能异常。除了对肿瘤细胞的作用,2-甲氧雌二醇还可阻断卵巢颗粒细胞有丝分裂,促进其凋亡[4],提示该药具有潜在的抑制卵泡血管生成的作用,故可进一步研究用于女性生殖系统血管相关性疾病的治疗。

    2  细胞周期停滞

  已证实2-甲氧雌二醇可以使鼻咽癌细胞[5],子宫颈癌细胞[6]和前列腺癌细胞[7]等很多肿瘤细胞的有丝分裂停滞于G2/M期,这可能与其抑制微管蛋白聚合以及对细胞周期的调节作用有关。

    2.1  抑制微管蛋白聚合  Robert W等[8]采用微管蛋白聚合检测,即将微管蛋白与2-甲氧雌二醇孵育(37℃)15min后转移至试管中,冰浴。加入GTP再恢复至室温,微管蛋白聚合开始,结果可见,3μmol/L 2-甲氧雌二醇可抑制微管蛋白聚合达34%。

    2.2  对细胞周期的调节作用  研究发现2-甲氧雌二醇抑制骨肉瘤143B细胞周期的作用是剂量依赖的,1μmol/L时33%的细胞停滞在G1期,10μmol/L时则有58%的细胞聚集在G2/M期[9]。2-甲氧雌二醇可通过细胞周期调节因子而发挥作用。P34cdc2和Cyclin B复合物是通过促进染色体浓缩、细胞骨架重构以及核膜降解来发挥调节细胞由G2期进入M期的进程的。而2-甲氧雌二醇作用于G2/M期MCF-7细胞后,可以显著降低P34cdc2的水平[10]。

    3  促进细胞凋亡

  细胞凋亡的途径通常有两条,一条是通过细胞外信号激活细胞内的凋亡蛋白酶caspase;一条是细胞应激反应或凋亡信号首先引起线粒体细胞色素c释放,然后作为凋亡诱导因子,细胞色素c与凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)、caspase-9前体、ATP/dATP形成凋亡酶体复合物,召集并激活caspase-3,进而引发caspase级联反应,这些活化的caspase可将细胞内的重要蛋白降解,导致细胞凋亡。2-甲氧雌二醇促进细胞凋亡的效应正是通过这两条途径发挥作用的[11],具体机制如下。

    3.1  促进活性氧(ROS)生成  目前普遍认为细胞色素c是通过线粒体膜通透性转运孔(MPT)释放到胞质中的,而当各种因素导致线粒体功能紊乱时,MPT的开放与细胞中ROS的堆积密切相关[12],后者又产生大量超氧阴离子自由基,使细胞凋亡呈现不可逆状态。2-甲氧雌二醇1μmol/L处理后的大鼠DS肉瘤细胞,过氧化脂质生成增高1.5倍,而浓度升至5μmol/L时,过氧化脂质生成增高2.2倍[13]。这一结果提示2-甲氧雌二醇可促进ROS的生成,进而引起该肿瘤细胞凋亡。

    3.2  促进p53表达  p53是一种抗癌基因,其生物学功能为在G期监测DNA的完整性。如出现DNA损伤,即抑制细胞增殖,直到DNA修复完成;如果DNA不能被修复,p53则是通过上调促凋亡基因Bax的表达,激活线粒体释放细胞色素c而诱导其凋亡。Carothers A等[14]分析2-甲氧雌二醇处理过的结肠癌细胞,显示p53蛋白的表达随2-甲氧雌二醇的浓度增加而增强。另一项研究也表明2-甲氧雌二醇可上调p53 mRNA及蛋白的表达,但若采用p53反义寡核苷酸转染细胞,则该药促细胞凋亡的效应受到抑制[15],进一步提示p53在2-甲氧雌二醇诱导细胞凋亡过程发挥着重要的作用。

    3.3  活化SAPK/JNK和Bcl-2家族  研究证实c-Jun氨基末端激酶(JNK)又被称为应激活化蛋白激酶(SAPK)信号转导通路在细胞增殖、分化及凋亡等过程中具有至关重要的作用。Shizhong Bu等[16]2-甲氧雌二醇10μmol/L处理人前列腺癌细胞(PC-3、LNCaP)和乳腺癌细胞(MDA-MB-468、MCF-7),可诱导SAPK/JNK磷酸化而使其活化,从而导致凋亡发生。同时由于Bcl-2在调节细胞存活和凋亡中发挥较为关键的作用,研究人员又将敲除Bcl-2的前列腺癌细胞(DU-145)用2-甲氧雌二醇处理,仍可诱导SAPK/JNK磷酸化而使其活化,但却不发生凋亡[16]。由此推测2-甲氧雌二醇的促凋亡效应与JNK活化及Bcl-2的磷酸化有关。

    3.4  抑制核转录因子NFκB  近来发现成神经管细胞瘤DAOY细胞株中NFκB启动子的活性增高,而经2-甲氧雌二醇(3μmol/L)处理后,NFκB启动子的转录活性降低78%[17]。目前已证明NFκB参与细胞凋亡过程的调控,但其抑制凋亡或促进凋亡的效应取决于所作用细胞类型和凋亡刺激物的不同。在另一项口腔癌细胞的实验中观察到2-甲氧雌二醇治疗后,NFκB的转录活性亦明显降低[18]。

    3.5  抑制Akt信号转导通路  Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在肿瘤发生发展过程中起关键作用。有资料显示[19]在很多肿瘤的发生过程中Akt活性增高。而强化Akt则可以阻断2-甲氧雌二醇介导的线粒体损伤、JNK活化及促凋亡效应,再加用PI3K(Akt信号转导通路中的第二信使)抑制剂LY294002则能加强2-甲氧雌二醇的促凋亡效应[20]。因此,提示Akt信号转导通路在2-甲氧雌二醇诱导凋亡过程中发挥重要作用。

    4  抑制血管新生

  Folkman于1971年提出肿瘤的生长与转移依赖于血管生成,肿瘤细胞不仅通过血管从宿主获得营养物质、排除代谢产物,同时也获得了转移的通路,故可通过阻断血管生成的方法来抑制肿瘤的生长和转移。血管生成的步骤包括基底膜和细胞外基质降解,血管内皮细胞粘附、迁移、增殖,形成管腔结构,最后生成新血管等,这一过程中,又受到许多生长因子如VEGF的调节。研究表明,2-甲氧雌二醇1μmol.L-1即可以抑制血管生成[21],而其抑制血管生成的效应正是通过阻断上述几个步骤实现的。

    4.1  抑制细胞外基质(ECM)降解  癌细胞与基底膜紧密接触后,即分泌蛋白溶解酶,如基质金属蛋白酶(MMPs)等降解ECM。基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMPs)则是MMPs的天然抑制物,两者在细胞外基质降解中的相互作用是肿瘤细胞的侵袭及转移的关键因素。Fajardo I等[22]检测2-甲氧雌二醇处理成神经细胞瘤(WAC-2细胞),发现MMPs/ TIMPs的平衡明显偏向于TIMPs,即发挥阻断细胞外基质降解的作用。

    4.2  抑制细胞粘附、迁移  细胞骨架常成为癌基因的攻击靶点,采用癌基因BCR-ABL可以诱导细胞骨架异常,从而影响细胞形态、运动、粘附及迁移等功能。将BCR-ABL 转化过的前B细胞经2-甲氧雌二醇处理后,粘附至纤连蛋白的细胞比例减少66%[23]。鉴于细胞粘附至细胞外基质纤连蛋白与其表面的α5β1整合素的模体结构精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸环肽(RGD)有关,2-甲氧雌二醇的此项作用似与减弱转化细胞表面整合素的功能有关。同时,2-甲氧雌二醇还可以降低BCR-ABL 转化过的前B细胞的迁移比例下降达到45%。

    4.3  诱导血管内皮细胞凋亡  2-甲氧雌二醇诱导血管内皮细胞凋亡是其抑制血管生成的重要机制之一,具体信号转导通路见前。Yue TL等[24]观察到在牛肺动脉内皮细胞的培养液中加入2-甲氧雌二醇,不仅可以从形态上观察到凋亡的发生,如染色质浓缩,核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等,还采用DNA片段分析等方法检测到了凋亡的发生。

    4.4  抑制血管内皮生长因子(VEGF)  研究发现2-甲氧雌二醇治疗24h后,头颈鳞状细胞癌细胞VEGF分泌降低57.7%[25]。目前认为,癌细胞能分泌大量VEGF,使肿瘤形成新的血管而快速生长,而血管内皮细胞也可分泌VEGF促使血管内皮细胞自身乃至肿瘤细胞的增殖。因此,血管如果没有VEGF诱导就不会同肿瘤相连接,肿瘤如果没有血管生长和得不到源源不断的血液供应就只能处于休眠状态,故降低VEGF可抑制肿瘤的生长和转移。

    4.5  抑制缺氧诱导因子(HIF)  HIF是一种转录因子,通过上调一些与血管新生和糖酵解有关的基因来介导组织细胞对低氧的适应。近年发现肿瘤细胞受到辐射后分泌HIF,以防止血管内皮细胞凋亡,使得幸存的肿瘤细胞继续通过它们获得营养,重新生成肿瘤[26]。实验表明,一旦HIF被激活,还会触发许多生长因子的产生,如VEGF、bFGF以及其他超过40种不同的调控代谢、转移和血管生成的蛋白信号。因此抑制HIF活化可以增强血管的破坏,大大增加肿瘤的放射敏感性。有科学家采用在低氧环境(1%O2)下培养HEK293细胞,发现经2-甲氧雌二醇处理过后可以显著降低HIF的转录活性,同时其抑制HIF积聚的作用是通过促进HIF1α蛋白降解,而不是抑制其合成[27]。但也有不同观点认为2-甲氧雌二醇作用后,HIF水平降低是由于HIF1α合成受抑,即使有促进蛋白降解的作用,也是通过不依赖蛋白酶体的其他通路[28]。具体细节有待深入探讨。

    5  细胞周期停滞、促进细胞凋亡以及抑制血管生成作用间的相互关系

  2-甲氧雌二醇的以上3种作用机制并不是互不相干,各自独立的。如其抑制血管生成作用中即包括诱导血管内皮细胞凋亡;而抑制HIF也可以阻断VEGF的激活;Akt信号转导通路激活后可导致JNK活化,并间接阻断p53及NFκB等因子等等。因此,2-甲氧雌二醇作用于不同的瘤株,其机制不同,但也不是唯一的,具体作用机制还有待于进一步研究。

    6  小结

  2-甲氧雌二醇(商品名:Panzem)已由EntreMed公司开发作为单一疗法用于稳定的或复发的多发性骨髓瘤和前列腺癌治疗、与多西他赛(docetaxel,Taxotere)联合用于激素难治性前列腺癌的II期治疗。与传统化疗不同,2-甲氧雌二醇靶向快速生长的细胞,并有相对较高的特异性,且不会杀死未分裂的细胞。其作用机制除了直接诱导癌细胞凋亡,阻止其恶性生物学行为方面的作用外,还通过抑制传输营养物质给肿瘤的血管的发育而成为有效的抗肿瘤药物。管2-甲氧雌二醇是雌激素的天然代谢产物,但却无雌激素内在活性,故与常规的化疗和放疗或其他基因疗法相比,具有很多优点,如高效低毒,不易产生耐药性,不受肿瘤细胞周期的影响,容易寻找到靶向血管;特别是在治疗过程中对血管的有限损伤就可造成大量肿瘤细胞的生长抑制,不会对骨髓和造血器官产生毒性;同时,肿瘤抑制血管生成治疗可用于多种恶性肿瘤的治疗,具有广谱性,已经显示出了良好的应用前景。虽然目前抑制血管生成治疗还处于实验室研究和临床试验阶段,还很难全面评价其临床应用价值,但随着血管生成和肿瘤发生机制的深入研究以及抗血管生成药物不断开发和深入研究,抑制血管生成治疗将成为继化疗、放疗、免疫治疗后一种新的肿瘤治疗方法。

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     (编辑:罗  彬)

    基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:30500631)
    作者单位: 20032 上海,上海市计划生育科学研究所药理毒理学研究室,中国生育调节药物毒理检测中心

作者: 王蕾,孙祖越,曹霖 2006-8-19
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