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【摘要】 目的 探讨1，25羟化维生素D3（骨化三醇）对人高转移巨细胞肺癌PGCL3细胞粘附、侵袭和迁移能力的影响。方法 MTT法检测其对PGCL3细胞生长的影响；分别用粘附相关基底膜成分分析实验、重组基底膜侵袭实验、Transwell室趋化运动模型研究骨化三醇对PGCL3细胞的粘附、侵袭和运动能力的影响。结果 骨化三醇明显抑制PGCL3细胞的生长。骨化三醇作用PGCL3细胞24h的IC50值为0.158 μmol/L。骨化三醇0.025、0.05、0.075μmol/L 处理PGCL3细胞24h，对PGCL3细胞侵袭能力的抑制率分别为12.94%、27.33%、38.22%，对PGCL3细胞运动能力的抑制率分别为8.70%、29.83%、43.62%。降低PGCL3细胞对层粘连蛋白、纤维粘连蛋白的粘附率，且其效果呈一定的剂量依赖关系。结论 骨化三醇抑制人高转移巨细胞肺癌PGCL3细胞的粘附、侵袭和迁移能力；骨化三醇对PGCL3细胞粘附和侵袭的影响与其降低PGCL3细胞对层粘连蛋白、纤维粘连蛋白的粘附率有关。
【关键词】 1，25羟化维生素D3；粘附；侵袭;迁移；人高转移巨细胞肺癌PGCL3细胞
Effects of 1，25（OH）2vit D3 on adhension，invasion and migration of a human highly metastatic giant lung carcinoma cell line PGCL3
WANG Chang-xiu，LIU-Yi.Institute of Laboratory Medicine of GDMC，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023，China
【Abstract】 Objective This study was designed to investigate the effects of 1，25-dihydroxyvitamin D3 on adhesion，invasion and migration of PGCL3 cells.Methods Cell grow inhibition was measured by MTT assay . The effects of 1，25（OH）2vit D3 on adhesion、invasion and migration of PGCL3 cells were determined using analysis of adhesion-related basement membrane components fibronectin and laminin，reconstituted basement membrane invasion assay，and Transwell model，respectively.Results 1，25（OH）2vit D3 displayed growth inhibitory activity against PGCL3 cells with IC50 values of 0.158 μmol/L for 24 hours of treatment. 0.025，0.05 and 0.075μmol/L of 1，25-dihydroxyvitamin D3 inhibited PGCL3 cells to invade the reconstituted basement membrane by 12.94%，27.33%，38.22%，and decreased the percentages of locomotion and migration of PGCL3 cells by 8.70%，29.83%，43.62%.In addition，1，25-dihydroxyvitamin D3 inhibited PGCL3 cells to adhere to the basement membrane components fibronectin and laminin.Conclusion 1，25-dihydroxyvitamin D3 can significantly inhibit the adhesion，invasion and migration of PGCL3 cells，and the suppression of adhesion of PGCL3 cells to fibronectin and laminin may be responsible for the inhibition of adhesion and invasion of PGCL3 cells.
【Key words】 1，25-dihydroxyvitamin D3;adhesion;invasion;migration;PGCL3 cells
侵袭和转移是不断改进性肿瘤最重要的恶性行为和治疗的主要障碍，是临床90%以上癌症患者的致死因素，因此，控制侵袭和转移成为恶性肿瘤患者预后的关键因素，研发具有抗肿瘤转移的新药有着十分重要的意义。1，25羟化维生素D3（1，25-dihydroxyvitamin D3）又名骨化三醇，是维生素D（Vitamin D，VitD）在肝脏和肾脏羟化酶的作用下最终被转化为其活性形式。近几年来其对肿瘤细胞的影响备受关注。骨化三醇对体外培养的几乎所有类型的肿瘤细胞有抑制或促分化作用，并且能够抑制、杀死或预防体内多种肿瘤［1～5］。但其对肿瘤的作用机制尚未完全明确，最近的研究结果表明骨化三醇的抗肿瘤作用与其抑制肿瘤细胞转移、侵袭和血管生成相关。目前，骨化三醇对人高转移巨细胞肺癌PGCL3细胞转移能力的影响还未见报道。本文对骨化三醇对人PGCL3细胞生长增殖、侵袭、运动和粘附能力的影响进行研究，为将其开发成为有效的临床抗肿瘤转移药提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 1，25（OH）2VitD3、MTT、纤维粘连蛋白（fibronectin，FN）、苏木精、伊红、优凯特均购自Sigma公司；超级无支原体新生牛血清购自杭州四季青生物材料有限公司；RPMI-1640购自美国Hyclone公司；层粘连蛋白（laminin，LN）购自北京大学医学部病理系；胰酶购自美国Gibco公司；Transwell室（直径6.5cm、孔径8μm）购自美国Costar公司；聚碳酸酯膜（直径13cm、孔径8μm）购自美国Millipore公司；胶原购自华美生物工程公司。其余试剂均为国产分析纯。人高转移巨细胞肺癌PGCL3细胞引自北京大学医学部病理系。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 PGCL3细胞培养于含10%小牛血清，100ku/L青霉素和100mg/L链霉素的RPMI-1640培养液中，37℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱培养。取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2 MTT法检测骨化三醇对PGCL3细胞生长的影响 取对数生长期细胞，接种于96孔板，每孔接种100μl（含5.0×103细胞）。培养过夜后，吸出培养液，加入新培养液90μl，及不同浓度的骨化三醇溶液10μl，使终浓度分别为0.05、0.10、0.15、0.20μmol/L。对照组则加入相同体积的培养液，每一浓度设8个平行孔。继续培养24h。每孔加入MTT(5g/L)20μl，培养4～6h。每孔加入三联液DMSO100μl。用ELX800型酶标仪在570nm波长处测量OD值，以Bliss法计算半数抑制浓度。
1.2.3 细胞侵袭实验 Transwell室朝上室方向的上膜面已铺好Matrigel，朝下室方向的下膜面涂纤维粘连蛋白10μl（约2μg），风干后放入已含有600μl含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的RPMI-1640培养液的下小室中，37℃孵育1h，取出备用。将经0.025、0.05、0.075μmol/L骨化三醇处理24h的PGCL3细胞重悬于含0.1%BSA的RPMI-1640培养液中，调整细胞浓度为1.0×109个/L，加100μl细胞悬液于Transwell室的上小室。对照组为未经骨化三醇处理的PGCL3细胞，每组设3个平行孔。在细胞培养箱孵育6h。取出上小室，甲醇固定3min，苏木精染色3min，水洗。伊红染色10s，水洗。擦去上膜面的Matrigel及未穿过膜的细胞，优凯特胶封片。在400倍光学显微镜下随机选择6个视野，计数每个视野穿过膜的细胞数。计算平均值，以穿过膜的细胞相对数目来表示肿瘤细胞的侵袭能力。侵袭抑制率=（1－实验组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数）×100%。
1.2.4 细胞运动实验 除膜上不涂纤维粘连蛋白外，其余方法步骤同1.2.3。
1.2.5 细胞与FN、LN的粘附实验 分别将5.0μgFN、LN铺于96孔板。用50μl含2%BSA的RPMI-1640培养液封闭1h，PBS洗2次，待用。将经0.025、0.05、0.075μmol/L骨化三醇处理24h的PGCL3细胞重悬于含0.1%BSA的无血清RPMI-1640培养液中，调整细胞浓度为8×108个/L，每孔加100μl细胞悬液，对照组为未经骨化三醇处理过的PGCL3细胞，每一浓度设8个平行孔。37℃孵育1h，吸去培养液，每孔加入200μl预热的PBS洗去未粘附细胞。每孔加入100μl MTT（0.1mg)，调零孔无细胞，于培养箱中继续培养4h后，每孔加入100μl DMSO，用ELX800型酶标仪在570nm波长处测量OD值，细胞粘附率按下式计算。细胞粘附率=实验组OD值/对照组OD值×100%。
1.2.6 统计学处理 数据采用均数±标准差（±s）表示，结果用Student′s t test进行统计分析。
2 结果
2.1 骨化三醇对人高转移巨细胞肺癌PGCL3生长的抑制作用 结果表明，骨化三醇可明显抑制PGCL3细胞的生长。骨化三醇作用PGCL3细胞24h的IC50为0.158μmol/L（见表1）。
表1 不同浓度骨三醇对PGCL3的生长抑制作用 (略)注：与对照组比较，***P＜0.001
2.2 骨化三醇对PGCL3细胞侵袭能力的影响 经骨化三醇0.025、0.050、0.075μmol/L作用24h后，PGCL3细胞侵袭重组基底膜的能力明显受到抑制，抑制率分别为12.94%、27.33%、38.22%（见表2）。
表2 骨化三醇对PGCL3细胞侵袭能力的影响 (略)注：与对照组比较，*P<0.01
2.3 骨化三醇对PGCL3细胞运动能力的影响 骨化三醇0.025、0.050、0.075μmol/L作用PGCL3细胞24h后，能抑制PGCL3细胞的运动能力，且呈剂量依赖性，抑制率分别为8.70%、29.83%、43.62%（表3）。
表3 骨化三醇对PGCL3细胞运动能力的影响 (略)注：与对照组比较，*P<0.01
2.4 骨化三醇对PGCL3细胞与FN、LN粘附能力的影响 见图1。
图1 骨化三醇对PGCL3细胞FN、LN粘附能力的影响
由图1看出0.025、0.050、0.075μmol/L的骨化三醇作用PGCL3细胞24h后能降低PGCL3细胞对基质成分LN、FN的粘附率，并呈一定的剂量依赖关系。
3 讨论
本实验结果表明骨化三醇能明显抑制PGCL3细胞生长，作用PGCL3细胞24h后的IC50为0.158μmol/L。而抗肿瘤侵袭、运动和粘附能力的药物其对肿瘤细胞的细胞毒作用应控制在10%左右，因此，选择0.025、0.050、0.075μmol/L骨化三醇来进行实验。这三个浓度的骨化三醇对PGCL3细胞的生长无明显影响(抑制率<10%)，但经实验表明可降低PGCL3细胞的侵袭能力，这说明骨化三醇抑制PGCL3细胞侵袭、粘附和迁移可能与其细胞毒作用无直接关系。近年来，肿瘤的侵袭转移机制的研究在细胞和分子水平上已取得了一不定期的进展。Liotta等提出侵袭过程分为“三步”：粘附、降解基底膜和基质运动。上述三步重复进行，使得肿瘤细胞向深层侵袭。0.075μmol/L骨化三醇即可明显抑制PGCL3细胞侵袭能力（抑制率38.22%）和细胞趋向性运动能力（抑制率43.62%），并能降低PGCL3细胞与细胞外基质成分FN、LN的粘附。因此，上述几项实验结果说明骨化三醇是通过抑制细胞粘附、运动而抑制PGCL3细胞的体外侵袭能力的。
【参考文献】
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(编辑：邓 锋)
作者单位： 1 524023 广东湛江，广东医学院检验学院
2 524023 广东湛江，广东医学院广东天然药物研究与开发重点室