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【摘要】 目的 研究灵芝主要成分三萜类化合物Ganodermenonol对胃癌和肝癌细胞生长的抑制作用。方法 (1)运用硅胶柱色分离法，从双灵固本散的氯仿提取物中分离三萜化合物Ganodermenonol。(2)采用经典化疗药物顺氯氨铂做对照，系统地研究双灵固本散的不同溶剂提取物对胃癌细胞和肝癌细胞的抑制作用；同时进行两种癌细胞抑制生长效果对照。(3)实验分析双灵固本散中氯仿提取物及其有效成分的含量测定。结果 (1)在双灵固本散药物中，每个溶剂的提取物都有一定的抗癌细胞作用，抗癌细胞作用较好的活性物质主要集中在非极性提取物中，其中三萜类化合物是其活性最强的成分之一，具有较高含量的高效抗癌成分Ganodermenonol在微克级即表现出明显抑癌细胞作用，是该药的最大特色。(2)双灵固本散的氯仿提取物及乙酸乙酯提取物对肝癌细胞BEL-7402，在浓度为0.125mg/ml时抑瘤率超过50%；三萜类化合物Ganodermenonol对肝癌细胞BEL-7402，在1.5μg/ml的剂量时抑瘤率超过50%，高达64%。氯仿提取物及乙酸乙酯提取物对胃癌细胞MGC-803在浓度为0.125mg/ml时抑瘤率高达83.1%。(3)双灵固本散中氯仿提取物占7.1%，乙酸乙酯占5.3%，Ganodermenonol占0.37%（w/w）。结论 双灵固本散所含三萜类化合物Ganodermenonol在微克级有明显抑制肿瘤细胞生长作用。
【关键词】 肝癌；胃癌；双灵固本散；氯仿提取物；三萜类化合物
Research on the tumor inhibiting action of triterpenoid compound (Sunrecome)
WENG Xin-chu,WANG Dan-hua,SONG Hong-sheng,et al.
School of Life Sciences， Shanghai University 200444,China
【Abstract】 Objective Ganoderma Lucidum is a traditional Chinese medicine of Fuzheng Guben. Experiments show that ganodermenonol, one of triterpenoid compounds which is the main component of Ganoderma Lucidum, has an inhibiting action to the growth of gastric carcinoma and liver cancer.Methods (1)Separation method of silica gel column chromatography, ie, the triterpenoid compound ganodermenonol separated from the chloroform extraction of Sunrecome has a strong action to inhibit the activity of cancer cells. (2) Using cisdiaminedichlorop , the classic drug in chemical therapy, as a contrast, we tried to find out whether the essence extracted from different solutions of Sunrecome has the same inhibiting action to gastric carcinoma and liver cancer. Meanwhile, we compared the inhibiting effect on the two different kind of cancers.(3) We estimated the exact quantity of the chloroform extraction of Sunrecome and its effective component.Results (1)Each one of the essence extracted from different solutions of Sunrecome has a certain effect on inhibiting the proliferation of cancer cell. While the more effective can be found in the non-polarity solution of Sunrecome, and one of the most active component is a triterpenoid compound called ganodermenonol, this compound can show its tumor inhibiting action at microgram level , constitutes the most attracting feature of this drug.(2) The chloroform extraction and the ethyl acetate extraction of Sunrecome can inhibit over 50% of the liver cancer cell BEL-7402 at the concentration of 0.125mg/ml; The triterpenoid compound ganodermenonol can inhibit as high as 64% of the liver cancer cell BEL-7402 at the dose of 1.5 ug/ml. As for the stomach cancer cell MGC-803, the chloroform extraction and the ethyl acetate extraction of Sunrecome can inhibit 83.1% of the tumor at the concentration of 0.125mg/ml.(3) The chloroform extraction makes up 7.1% of Sunrecome, and 5.3% for ethyl acetate extraction , 0.37% for ganodermenonol (w/w).Conclusion Ganodermenonol contained in sunrecome has an obvious effect on inhibiting the growth of tumor at the level of microgram.
【Key words】 liver cancer;stomach gastric;sunrecome;triterpenoid;ganodermenonol
灵芝已成为抗癌中药的代表之一［1］。灵芝和灵芝孢子粉富含多糖类、三萜类、多种氨基酸、生物碱、核苷等成分，具有扶正固本、增强免疫的作用，呈现明显的抗肿瘤［2～4］、抗衰老、抗菌［5］、抗病毒［6～8］等生理活性作用。近年来广泛研究证实，灵芝及灵芝孢子粉对多种移植动物肿瘤有明显的抑制作用［9～11］；灵芝精粉和灵芝孢子粉混合物对人淋巴母细胞白血病细胞、人胃中分化腺癌细胞、人肺腺癌细胞、人肝细胞肝癌细胞、人结肠低分化腺癌细胞、人卵巢浆液性腺癌细胞等，有直接抑制癌细胞生长作用［12］。研究结果表明，灵芝三萜化合物［13～15］具有强烈的药理活性，有抑制组胺释放、止痛、解毒、保护肝脏和骨髓、杀死肿瘤细胞［16］等功能。灵芝多糖在肠道内通过介子作用激活肠黏膜下淋巴群体内的树突状细胞，产生增强细胞免疫和体液免疫作用，调节核酸抑制肿瘤细胞生理活性［17］，并能提高白细胞介素的产生。本研究用双灵固本散氯仿提取物及三萜化合物Gandermenonol对肝癌细胞BEL－7402细胞的增殖影响，对胃癌细胞MGC－803细胞的增殖影响，同时用顺氯氨铂进行实验对照，以期获得三萜化合物Gandermenonol在微克级直接抑制肿瘤细胞生长的证据。
1 材料与方法
1.1 受试药物 双灵固本散由上海绿谷生物医药研究所提供；双灵固本散氯仿提取物：将40g 双灵固本散以索氏抽提法，抽提24h。回收氯仿，恒重得氯仿提取物2.84g，得率为7.1%。双灵固本散氯仿提取后用乙酸乙酯索氏提取，得乙酸乙酯提取物2.12g，得率为5.3%。两次提取后的剩余物，得率为87.6%，其主要成分为多糖、蛋白及灵芝孢子残留物；Ganodermenonol是从氯仿提取物中通过硅胶柱色谱分离得到，占整个双灵固本散的0.37%。其具体分离和结构鉴定见后面的详细报告。顺氯氨铂（DDP）由山东齐鲁制药厂提供。
1.2 细胞株 肝癌细胞BEL-7402、胃癌细胞MGC-803、肝正常细胞HL-7702由中国科学院上海细胞所提供。
1.3 主要仪器 CO2培养箱，Thermo Forma公司；酶标仪，96孔板。
1.4 主要试剂 RPMI 1640培养基和MTT，Sigma（美国）；胰酶，Diffco（美国）；EDTA（AR），上海生工生物工程有限公司；二甲基亚砜（DMSO），AMRESCO公司。
1.5 方法 对癌细胞生长抑制作用测定。细胞在37℃，100%相对湿度，含5% CO2、95%空气的培养箱内，含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中贴壁生长，到达对数生长期后以0.25%胰酶溶液-0.02% EDTA溶液消化传代，以100μl（1.0×104/ml）剂量浓度接种于96孔平板。孵育24h后，倾去培养液，将用培养液配好的不同浓度药物分别加入孔内，每一浓度加4孔，每孔100μl，空白组加同量培养液，对照组加顺氯氨铂溶液。孵育24h后，仔细吸去上清液，用PBS溶液洗涤2次，随后每孔加入的MTT溶液100μl（浓度0.5mg/ml，用无血清培养液稀释），37℃继续孵育4h，吸去上清，每孔加二甲基亚砜（DMSO）150μl，摇床上震荡15min或37℃温育30min。酶联免疫仪490nm波长处检测各孔吸光度（A值）。
2 结果
2.1 顺氯氨铂（DDP）对肝癌细胞BEL-7402细胞增殖影响 见表1。
表1 顺氯氨铂（DDP）对肝癌细胞BEL-7402细胞增殖影响（略）
从表1中可以看出，化疗药物DDP在0.1μg/ml时对肝癌细胞基本没有影响，而达到1μg/ml时，影响比较显著，在5μg/ml的剂量下，已经超过80％的抑瘤率，并且随其浓度上升，其抑制癌细胞的效果迅速提高之。但是，在DDP的浓度在5μg/ml以上时，其抑制癌细胞的效果随浓度的上升而提高不明显。
2.2 双灵固本散、双灵固本散的氯仿提取物、双灵固本散的乙酸乙酯提取物以及乙酸乙酯提取后的剩余物对肝癌细胞BEL-7402细胞增殖影响见表2。
表2数据证实，双灵固本散、双灵固本散的氯仿提取物、双灵固本散乙酸乙酯提取物以及乙酸乙酯提取后的剩余物对肝癌细胞的抑制作用都很明显，并且存在一定的量效关系，以氯仿提取物的抑制效果最为显著，在浓度为0.125mg/ml时，抑瘤率超过50%，而当其浓度达到1mg/ml时，其抑制效率达到近90％。从乙酸乙酯抑制肝癌细胞BEL-7402的效果看，在低浓度0.125～0.5mg/ml时，其效果低于氯仿提取物。氯仿和乙酸乙酯萃取后的剩余物主要是多糖、灵芝孢子，有抑制癌细胞的活性作用。其效果远远低于氯仿提取物和乙酸乙酯提取物。乙酸乙酯萃取后的剩余物即使在10mg/ml的浓度时，其抑制癌细胞的效果之相当于0.5mg/ml的氯仿提取物。双灵固本散比乙酸乙酯萃取后的剩余物要高，但比氯仿提取物和乙酸乙酯提取物都弱。
2.3 Ganodermenonol对肝癌细胞BEL-7402细胞增殖影响 见表3。
表2 各药对肝癌细胞BEL-7402细胞增殖的影响 (略)
表3 Ganodermenonol对肝癌细胞BEL-7402细胞增殖的影响 (略)
表3可知，从双灵固本散萃取得到的三萜类单体化合物Ganodermenonol的抑癌活性很大，在1.5μg/ml的剂量下就有良好的抑癌效果，抑瘤率超过50％，高达64％，效果明显大于双灵固本散的氯仿提取物。目前从灵芝中分离鉴定的三萜化合物为103种，而笔者分离得到的Ganodermenonol只是其中主要的成分之一，也是抗癌活性最强的三萜化合物之一。
2.4 顺氯氨铂（DDP）对胃癌细胞MGC-803细胞增殖影响 见表4。
表4 DDP对胃癌细胞MGC-803细胞增殖的影响 (略)
对比表1与表4数据可知，DDP对肝癌细胞BEL-7402与胃癌细胞MGC-803的抑制效果基本一致。
2.5 双灵固本散、双灵固本散的氯仿提取物、双灵固本散乙酸乙酯提取物以及乙酸乙酯提取后的剩余物对胃癌细胞MGC-803细胞增殖影响 见表5。
表5 各药对胃癌细胞MGC-803细胞增殖的影响 (略)
分析表5数据可得知，同样，双灵固本散、双灵固本散的氯仿提取物、双灵固本散乙酸乙酯提取物以及乙酸乙酯提取后的剩余物对胃癌细胞的抑制作用存在一定的量效关系，尤其以氯仿提取物的抑制效果最为显著。氯仿提取物在0.125mg/ml的浓度时其抑制胃癌细胞BEL-7402效率就达到83.1%，在0.25mg/ml的浓度时，就达到90.4%。
和表2数据相比较，胃癌细胞比肝癌细胞对氯仿提取物更加敏感，由此推测，双灵固本散及其氯仿提取物对胃癌的疗效比肝癌可能更有效。
3 讨论
灵芝新型抗癌制剂，一直是医学界引人注目的课题，现代药理和临床研究证明，灵芝具有多方面的生理活性和药理作用［18，19］。近期国内外研究证明，灵芝制剂对小鼠移植性肿瘤的生长有抑制作用，对人多种癌细胞株体外实验有显著的抑制作用。并且能增强人体免疫功能达到间接的抑杀癌细胞作用［20］，临床研究有大量的报告灵芝制剂同放疗、化疗联合应用有明显增效及良好的减毒作用［21～23］。目前人类能够优良的栽培灵芝，并能做到产业化，也能不断地改进提高灵芝的加工技术和萃取方法；但是高科技的今天对灵芝的成分和化学结构仍处在继续探索之中，尤其对灵芝三萜类还不能做到完全识别，药理作用仍需深入研究。对灵芝多糖是如何促进人类免疫功能的机制仍需进一步探讨，目前还达不到全面的发挥灵芝多糖在人体抗病能力中的作用，多糖利用率仍需研究。
本实验具有的特殊性为：将灵芝新型制剂双灵固本散的不同溶剂提取物、氯仿提取物、乙酸乙脂提取物、乙酸乙脂提取物后的剩余物、三萜类单体Ganodermenonol进行了药理活性对照研究，达到了单一成分的深入药理研究，取得了满意的结果，对灵芝三萜类化合物的深入研究起到了推进作用，对深化灵芝的药理研究作出了贡献。从本实验体外培养细胞结果，获得了非常有意义的结论：(1)从抑癌效果来看，双灵固本散的氯仿提取物对肝癌和胃癌细胞抑制效果比灵芝的其他提取物都要强。(2)双灵固本散各个提取物对胃癌细胞的抑制效果比对肝癌细胞的抑制效果要明显。(3)所分离得到的一种三萜化合物单体Ganodermenonol抑制癌细胞的活性很强，在微克级即表现明显的抗癌作用，可与经典化疗药物顺氯氨铂相媲美。但灵芝产品不但有抑癌效果，并且有明显的提高人体免疫系统的作用，在化疗的过程中能保护正常细胞［24］，这是其他化学治疗药物无法相比的。(4)分离得到的一种三萜类化合物单体Ganodermenonol, 得到Ganodermenonol晶体占双灵固本散高达0.375％,有非常强的抗癌细胞作用。
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(编辑：石 岚)
作者单位： 200444 上海，上海大学生命科学院
201203 上海，上海绿谷生物医药研究所