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【摘要】 本课题用人细胞肿瘤转移基因芯片对双灵固本散处理前后人肺癌细胞95-D肿瘤转移相关基因的表达水平变化进行定量研究。在检测到有明显差别表达的6个肿瘤转移相关基因中，2个基因的mRNA丰度在药物处理后明显升高，4个基因的mRNA丰度在药物处理后明显降低。结论：双灵固本散对肺癌细胞肿瘤转移有抑制作用，但还需要在蛋白和酶活性水平上的证据及进一步的活体实验。
【关键词】 灵芝；双灵固本散；肿瘤转移；肺癌
The regulation of sunrecome(shuanglinggubensan) on the expression of metastasis related genes in human lung tumor cell
LI Zhi-hong,WANG Tao,WU Hou,et al.
School of Life Sciences of Shanghai University, Shanghai 200436,China
【Abstract】 In this research work, the change of the expression of the metastasis related genes in cultured lung tumor cell 95-D after treatment with a commercial traditional Chinese medicine product -Sunrecome(Shuanglinggubensan) was measured, by using metastasis related gene array (purchased from Superarray). And the drug treatment up-regulated the expression of 2 metastasis related genes markedly, while the expression of 4 metastasis related gene was down-regulated.
【Key words】 ganoderma lucidum Karst;sunrecome(Shuanglinggubensan);metastasis;lung tumor
肿瘤是一种常见病、多发病，其中恶性肿瘤是目前危害人类健康最严重的一类疾病。典型的恶性肿瘤的自然生长史可以分成几个阶段：细胞的恶性转化→转化细胞的克隆性增生→局部浸润→远处转移。具有局部浸润和远处转移能力是恶性肿瘤细胞特有的性质，并且是恶性肿瘤威胁病人健康与生命的主要原因。因此，对肿瘤转移的预防与抑制是肿瘤治疗的关键。近年来对肿瘤转移的研究越来越受到重视［1］，对肿瘤生长与扩散的研究也已成为肿瘤病理学的重要内容。
灵芝（Ganoderma lucidum Karst）是一种传统中药，属于担子菌纲、多孔菌科、灵芝属，历代医家都认为灵芝能滋补强身，治疗多种疾病。现代药理研究表明，灵芝具有很强的抗肿瘤活性，已证明灵芝能有效抑制肿瘤组织血管生成［2］，抑制肿瘤转移［3，4］，诱导人乳腺癌细胞［5］、胸腺癌细胞［6］、前列腺癌细胞［7］、结肠癌细胞等凋亡的作用。
肺癌是我国高发肿瘤之一，而肺癌转移又是肺癌死亡的主要原因，因此，研究肺癌的转移机制，寻找理想的肿瘤转移抑制剂，将为肺癌的预防和治疗的改善提供可靠依据。本研究以人肺癌细胞95－D为实验材料，采用基因芯片法研究双灵固本散对人肺癌细胞肿瘤转移的影响，以期为双灵固本散良好的疗效提供更全面的理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料 双灵固本散由上海绿谷（集团）公司生物医药研究所提供；人肺癌细胞95-D购于中科院细胞所；人肿瘤转移基因芯片（GEArray Q Series Human Tumor Metastasis Gene Array）购于美国Superarray公司。
1.2 仪器CO2培养箱，Thermo Forma公司；倒置显微镜，Nikon公司；Gene Quant核酸定量仪, Pharmacia Biocech公司；Heraeus高速冷冻离心机，Biofuge公司；Mill-Q超纯水净化仪，Millipore公司； 1640完全培养液，Bibgo公司；Trizol试剂，上海生工生物工程技术有限公司提供，其余药品均为进口试剂。所有实验用品均经灭菌处理。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养 将对数生长的肺癌细胞95-D置于37℃，100%相对湿度，含5%二氧化碳、95%空气的培养箱中，在含15%小牛血清的RPMI 1640培养液中贴壁生长，以EDTA-胰酶混合溶液消化传代。
1.3.2 细胞的药物处理 以20ml（1.0×105/ml）剂量浓度接种在50ml培养瓶中，孵育24h后，倾去培养液，将加药培养液（10mg/ml）加入3个生长95-D的培养瓶中，每瓶20ml，对照组每瓶加20ml不加药物的1640培养液，孵育24h后，倾去培养液，每瓶加5ml胰酶溶液消化，待细胞脱壁后，将消化液转移至15ml离心管中，50g离心5min，倒出上清液，细胞沉淀于离心管中液氮冷冻，然后转移到-70℃保存。
1.3.3 细胞总RNA的提取 将药物处理过的细胞样品和对照细胞样品（每管约1×107个细胞）分别用1ml的Trizol试剂重悬，用匀浆器将细胞匀浆，然后按生工提供的方法提取总RNA，将70％乙醇洗过的RNA溶解于DEPC处理过的水中，并用GeneQuant定量。
1.3.4 cDNA探针的标记 按Superarray公司提供的方法标记对照和处理样品的cDNA。总RNA的用量为15～20μg。
1.3.5 芯片的杂交及检测 按GEArray Q Series Human Tumor Metastasis Gene Array试剂盒及其化学发光检测试剂盒的方法进行，稍有改动。
1.3.6 芯片检测结果的分析 用ScanAlyser和GEArray Analyzer软件分析杂交的结果。每个基因的表达量用每个杂交点的信号强度除以看家基因GAPD的强度表示。基因的表达水平变化=药物处理细胞中基因表达水平/未经药物处理细胞中基因表达水平。变化超过3倍即认为变化显著。
2 结果
笔者用GEArray Q系列人癌细胞转移检测芯片，对双灵固本散处理和未经药物处理的肺癌细胞95-D中与肿瘤转移有关的96个基因的表达水平进行了杂交检测。观察到双灵固本散处理后的肺癌细胞有少数几个基因的表达发生了变化(图1)。其中6个显著变化的基因（表达量>1.0E-1）中，2个表达明显升高，4个表达明显降低（表1）。
Fig.1 A.The hybridization of the biotin-labeled cDNA from the drug treated lung cancer cell to the GEArray Q seris Human Metastasis Gene Array(Catalog No.HS-007N purchased from Superarray).（略）
B.The hybridization of the biotin-labeled cDNA from non-drug-treated lung cancer cell to the same array as in A.（略）
Table1. The quantitation of the Fig 1 hybridization (human metastasis)by ScanAlyze and GEArray Analyzer（略）
3 讨论
基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP)是自然界进化中高度保守的一类酶，广泛分布于植物、脊椎动物、无脊椎动物中，是细胞外基质降解过程中必不可少的酶，几乎能降解细胞外基质的所有成分。在正常稳定状态组织中MMP表达量极少，而在炎性细胞因子、激素、生长因子刺激下和细胞转化过程其表达量上升。此过程涉及人体多种生理及病理过程，如炎症、胚胎发生、血管形成、肿瘤侵袭转移等［8］。许多体外研究均显示MMP过度表达多伴发侵袭的表型，实验资料提示明胶酶表达与转移有关［9］。
Osteopontin是一种分泌型钙结合磷蛋白，它能与矿化骨组织中的轻磷灰石紧密结合，参与调节骨钙的沉积。Osteopontin通过其RGD序列与整合素αvβ3受体的相互作用，在成骨细胞和破骨细胞与骨基质结合的过程中起重要作用。Osteopontin在肿瘤细胞的转化、浸润和转移中发挥重要作用［10］。
鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase, ODC)是多胺生物合成过程中的限速酶。因此ODC基因表达增强、ODC活性升高,可导致多胺生物合成增加，与肿瘤的发生、发展有密切关系。几乎所有的动物肿瘤中均发现ODC表达异常［11］。
Rac作为信号转道分子，属于Rho蛋白家族一员，参与调节细胞间的粘附，哺乳类的诱导因子(SIF)同源物T淋巴瘤侵袭诱导因子(Tiaml)，作为Rac的鸟苷酸交换因子(GEFs)之一，能诱使整合素迁移到细胞周边特异的粘着部位。在MDCK细胞里，Tiaml的表达能提高由钙依赖性粘附分子调节的细胞间粘附。在进行鼠纤维母细胞浸润胶原基质的实验中发现Rac的活性不可缺少［12］。
在表达差异的6个基因中，两个促进肿瘤转移的基因表达升高，4个促进肿瘤转移的基因表达降低。这些变化反映了细胞中代谢的变化，表明双灵固本散对肺癌细胞肿瘤转移有一定抑制作用，但就双灵固本散对肿瘤转移的作用而言，还需要在蛋白和酶活性水平上的证据及进一步的活体实验。
【参考文献】
1 Hejna M, Raderer M，Zielinski CC. Inhibition of metastases by anticoaguants. Cancer Inst，1999，91: 22.
2 Kimura Y, Taniguchi M, Baba K. Antitumor and antimetastatic effects on liver of triterpenoid fractions of Ganoderma lucidum: mechanism of action and isolation of an active substance. Anticancer Res，2002，22(6A):3309-3318.
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4 Liu X, Yuan JP, Chung CK,et al. Antitumor activity of the sporoderm-broken germinating spores of Ganoderma lucidum. Cancer Lett，2002，182(2):155-161.
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6 Lakshmi B, Ajith TA, Sheena N,et al. Antiperoxidative,anti-inflammatory, and antimutagenic activities of ethanol extract of the mycelium of Ganoderma lucidum occurring in South India. Teratog Carcinog Mutagen,2003,Suppl 1:85-97.
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9 Pei D, Weiss SJ. Transmembrane-deletionmutants of the membrane type matrix metalloprote inase-1 process progehtinase A and express intrinsic matrix degrading activity. Nature, 1995, 375(6528): 244-247.
10 Ross FP，Chappel J，Alvarez JI，et al .Interactions between the bone matrix proteins osteopontin and bone sialoprotein and the osteoclast integrinαvβ3 poentiate bone resorption. J Biol Chem，1993，268: 9901-9907.
11 O’Brien TG, Megosh LC, Gilliard G, et al. Ornithine decarboxylase over expression is a sufficient condition for tumor promotion in mouse skin. Cancer Res, 1997, 57(13): 2630-2637.
12 Sander EE，van Delft S，ten Hlooster JP，et al.Rac downregulates Rho activity: reciprocal balance between both GTPases determines cellular morphology and migratory behavior. J Cell Biol，1998 ,143(5) :1385-1398.
(编辑：余 强)
作者单位： 200436 上海，上海大学生命科学学院