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【摘要】 研究以芒萁［Dicranopteris dichotoma (Thunb.) Bernh.］、类芦［Neyraudia reynaudiana( Kunth) Keng］和象草( Pennisetum purpureum Schumach) 等草本植物粉末为主要原料栽培的灵芝子实体多糖肽提取的最佳条件,并检测了多糖肽的重金属含量。结果表明,提取子实体多糖肽的最佳条件为样水比1∶15 ,温度100℃,时间3h。
【关键词】 草栽灵芝;多糖肽;提取;重金属;检测
Study on the extraction conditions of polysaccharide-peptides of ganoderma lucidum cultivated with grasses
LIN Shu-qian,WANG Shai-zhen,LIN Zhi-bin,et al.
Fuzhou Green Valley Institute of Bio-Pharmaceutical Technology, Fuzhou 350002 ,China
【Abstract】 The optimal conditions for the extraction of polysaccharide-peptides from Ganoderma lucidum fruitbodies cultivated with grasses were studied. The heavy metal contents in the extract were also determined. The results showed that the optimal rate of fruitbody powder to water , the temperaure and time for extracting polysaccharide-peptides from Ganoderma lucidum fruitbodies cultivated with grasses such as Dicranopteris dichotoma ,Ney raudia reynaudiana and Pennisetum purpureum were 1∶15 ,100℃ and 3h resp.The extraction rate of polysaccharide-peptides from the fruitbodies cultivated with grasses was 1～3 times to those cultivated with log under the same conditions.
【Key words】 grass-cultivated ganoderma lucidum ; polysaccharide-peptide ; extraction ; heavy metal ; determination
灵芝［Ganoderma lucidum (Curt.:Fr.) Karst］具有多种生理活性和药理作用［1］。为探讨草栽灵芝多糖肽替代段木栽培灵芝多糖肽的可行性,林树钱等［2］ 研究了草栽灵芝子实体多糖肽提取的最佳条件,发现草栽灵芝除了多糖肽的主要理化特性与段木灵芝相似外,多糖肽含量接近段木灵芝。曹立珍、林志彬等［2］ 对上述两种多糖肽做了小白鼠体内免疫活性的比较实验,发现草栽灵芝在免疫活性与药效方面可以替代段木灵芝与段木灵芝相近。
笔者以草本植物为原料栽培灵芝,研究草栽灵芝多糖肽提取的最佳条件,并将草栽灵芝多糖肽得率和重金属含量与段木灵芝作了比较,为应用草栽灵芝作为药材提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试灵芝 草栽灵芝子实体由福建农林大学菌草研究所提供［3］,段木灵芝分别来自泰宁县和尤溪县绿谷灵芝基地。
1.1.2 培养料 培养料以芒萁［Dicranopteris dichotoma (Thunb.) Bernh］ 、类芦［Neyraudia reynaudiana (Kunth) Keng］和象草(Pennisetum purpureum Schumach) 等草本植物粉末为主要原料。
1.1.3 仪器与设备 FD2200刀式粗颗粒粉碎机,上海中药机械厂产品;SENCO全系列旋转蒸发器,上海申生科技有限公司产品; Scout Ⅱ电子天平(感量±0. 01g), 美国Ohaus 公司产品;DHJ2DW Ⅲ无压缩循环煎药机,韩国京西株式会社产品;LXJ2 Ⅱ离心沉降机,上海医用分析仪器厂产品;2002 型(AFS) 原子荧光分光光度计,北京海光光学仪器厂产品;AA26701F 原子吸收分光光度计,日本岛津公司产品;F732-G测汞仪,上海华光仪器厂产品。
1.2 多糖肽提取方法［4，5］
1.2.1 热水浸提法 将1～3mm 子实体粉末300g,用10倍量的95%乙醇加热回流3h,醇提后的灵芝粉末以不同比例的热水浸提。
上述热水提取液经3000rpm离心15min,取上清液,用旋转蒸发仪减压浓缩至原体积的1P10,相当于每毫升含灵芝生药1g ;再离心除去残渣,取上清液,用三倍量95%乙醇沉淀,沉淀物为灵芝多糖肽。将多糖肽溶于水中,用上述方法再沉淀提纯2次;最后将沉淀的多糖肽分别用95%乙醇、丙酮和乙醚各洗涤3次,置于低温真空干燥、称重。将上述多糖肽溶于蒸馏水中,置透析袋内(截流分子量> 5000),逆流透析48h,取出透析液,于80～85℃下减压浓缩,乙醇沉淀物按上法操作,经95%乙醇、丙酮、乙醚洗涤,低温干燥、称重,即为透析后灵芝多糖肽的重量。
1.2.2 多糖肽得率 多糖肽得率=透析后多糖肽重量P子实体粉末重量×100%。
1.2.3 灵芝多糖肽提取条件优化试验 草栽灵芝子实体粉末与水的比例分别为1∶10 、1∶15 、1∶20 和1∶25 ;提取温度分别为70℃、80℃、90℃和100℃;提取时间分别为1h、2h、3h和4h。以正交试验找出最佳提取条件,并比较提取次数对多糖肽得率的影响。
1.2.4 重金属测定 重金属测定依据为As:GB/T5009. 11-96; Pb:GB/T5009. 12-1996; Hg:GB/T5009.17-1996.
1.2.5 统计学处理 数据用SAS软件统计。
2 结果与分析
2.1 提取条件对多糖肽得率的影响 笔者考察了加水量、提取时间和提取温度三个影响多糖肽得率最为直接的因素(表1),以多糖肽得率为指标作正交试验(表2,表3)。
表1 正交试验因素和水平（略）
表2 L16(43)正交试验设计与结果（略）
Table 2 L16( 43) orthogonal test and result
表3 方差分析结果（略）
Table 3 Results of variance analysis
由表2的极差值R和表3的方差分析结果可以看出,3种因素对多糖肽得率的影响程度依次为B>A>C。提取温度对多糖肽得率影响最大,各因素的最佳水平组合为A2B4C3,多糖肽得率为2.2%。即最佳提取条件为加水15倍、于100℃下浸提3h,多糖肽得率最高。
2.2 提取次数对多糖肽得率的影响 根据正交试验因素最佳水平组合A2B4C3,提取时间(C) 对多糖肽得率影响最小,设为可变因素;样水比1∶15 和提取温度100℃设为不变因素,研究提取次数对多糖肽得率的影响(表4) 。
表4 提取次数对多糖肽得率的影响 (略)
Table 4 Effect of extraction nos. on polysaccharide-peptide yield
实验结果表明,第一次提取2.5h,已提取出大部分多糖肽,剩余的23.52 %,需考虑在第2次或第3次再提取,以提高多糖肽得率。
2.3 灵芝采收期对多糖肽得率的影响 笔者分别用福建农业大学菌草所提供的1999年8月底采收的草栽灵芝子实体(生长期120d,菌盖> 5cm,菌盖中心厚度1cm) 与该所在2001 年7月底采收的草栽灵芝子实体(生长期75天,菌盖< 5cm,菌盖中心厚度1.5cm) 供试,两者多糖肽得率分别为2.35%(3n) 和0.97%(10n);当年段木栽培灵芝(菌盖5～8cm,菌盖中心厚度>1cm)分别采自福建泰宁县和尤溪县灵芝基地,其多糖肽得率分别为0.78%(3n) 和0.84%(10n) 。由此可见,草栽灵芝子实体多糖肽得率是段木灵芝的1～3倍。草栽灵芝多糖肽得率与子实体生长季节、子实体生长周期有密切关系,而段木灵芝多糖肽得率比较稳定。
2.4 重金属检测结果 草栽灵芝多糖肽和段木灵芝多糖肽中重金属含量的测定结果见表5。
表5 草栽灵芝与段木灵芝多糖肽中的重金属含量（略）
Table 5 Heavy metal content in polysaccharide-peptides of grass and log cultivated G. lucidum(mg/kg)
结果表明,两种多糖肽中As、Hg含量均符合有关规定, Pb含量符合规定限量(参照保健食品重金属限量规定)。
3 讨论
3.1 草栽灵芝多糖肽的最佳提取工艺条件 子实体粉末加15倍水,于100℃浸提3h,可提出绝大部分多糖肽。增加提取次数,可提高多糖肽得率。
3.2 实验结果 草栽灵芝中多糖肽得率相对高于段木灵芝。但草栽灵芝中多糖肽得率波动范围较大,而段木灵芝多糖肽得率比较稳定。这与草栽灵芝子实体生长季节、气温高低和生长时间长短等因素密切相关。
【参考文献】
1 林志彬. 灵芝的现代研究，第2版.北京:北京医科大学出版社,2001，219-277.
2 Lin ZB. Ganoderma : Genetics,Chemistry, Pharmacology and Therapeutics ( Proceedings of International Symposium on Ganoderma Researech October 21～23,2002,Shanghai,China).Beijing : Beijing Medical University Press, 2002,109-114；115-121.
3 林占火喜. 菌草学. 北京:北京农业科技出版社,2000，96-102.
4 徐宝梁. 食用菌多糖肽提取方法研究. 食用菌,1996,18 (1) :6.
5 赵东旭,杨新林,陈霖,等.灵芝孢子中抗肿瘤成分的提取与分离. 中国中药杂志,2000,25 (5) :288.
(编辑：余 强)
* 基金项目：上海绿谷集团科研专项基金项目(编号：2003EAT20021)
作者单位： 350002 福建福州，福州绿谷生物药业技术研究所
100083 北京，北京大学医学部药理系