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【摘要】 目的 建立甲磺酸托烷司琼注射液细菌内毒素的检查方法，借此比较《中国药典》2000年版和2005年版对该检查项目描述的改变。方法 按《中国药典》2000年版二部附录XIE、XIXF进行实验和结果判断。结果 用2个不同生产厂家，不同标示灵敏度鲎试剂进行研究，甲磺酸托烷司琼注射液最大不干扰浓度为0.02 mg/ml，并对生产厂家的3批样品进行检查，均无干扰作用，其细菌内毒素量均小于25 EU/mg。结论 本品可以用细菌内毒素检查法（凝胶法）代替热原检查法控制细菌内毒素的含量，甲磺酸托烷司琼注射液的细菌内毒素理论限值为25Eu/mg。
【关键词】 甲磺酸托烷司琼注射液；细菌内毒素；凝胶法；干扰试验；限值
【Abstract】 Objective To set up the bacterial endotoxin determination method for tropisetron mesylate injection and compare the changes on description of Chinese pharmacopeia 2000 vol Ⅱ and 2005 vol Ⅱ. Methods The experiment and the judgment of its result were made according to the appendix XI E, XIX F of Chinese pharmacopeia 2000 vol Ⅱ.Results The reaction with two sensitivity of limulus lysate supplied by two business respectively was not disturbed in 0.02mg/ml，it is the maximum nondisturb concentration of tropisetron mesylate injection. The endotoxin content was even less than the limit (25Eu/mg) in each of three lots tropisetron mesylate injection without interference.Conclusion Limulus lysate method can be used in place for pyrogen monitoring of tropisetron mesylate injection. The limit is 25 Eu/mg.
【Key words】 tropisetron mesylate injection; bacterial endotoxin; gel-clot; interfering test;limit
近年来，细菌内毒素检查法在药品检验领域逐渐取代热原检查法，用以控制产品质量，是药品检验方法发展趋势。细菌内毒素检查法具有准确、灵敏、简便的特点。本试验是根据《中国药典》2000年版细菌内毒素检查法应用指导原则的要求，对甲磺酸托烷司琼注射液细菌内毒素检查的可行性进行方法学验证，为该制剂质量标准中制定细菌内毒素检查项提供依据。
1 实验材料
1.1 甲磺酸托烷司琼注射液(Tropisetron Mesylate Injection) 规格2ml：6mg，北京四环医药科技股份有限公司生产，批号 0406241；0406242；0406243。
1.2 鲎试剂（TAL） 规格均为0.1ml，标示灵敏度0.125Eu/ml，批号0310291， 湛江安度斯生物有限公司生产；标示灵敏度0.25Eu/ml， 批号040106，湛江海洋生物制品厂生产；标示灵敏度0.125Eu/ml，批号20040715， 湛江海洋生物制品厂生产；标示灵敏度0.125Eu/ml，批号0403291，湛江安度斯生物有限公司生产。
1.3 细菌内毒素工作标准品 规格200Eu/支，批号2003－10，中国药品生物制品检定所。
1.4 细菌内毒素检查用水 规格10ml/支，批号0402011，大同市惠达药业有限公司生产。经检查，符合《中国药典》2000年版对细菌内毒素检查用水的要求。
1.5 仪器 电热恒温水浴箱，湖北省黄石市医疗器械厂生产；H-1微型混合器；上海沪西仪器厂生产。
1.6 试验所用玻璃器皿 均250℃干烤1h，用以除去细菌内毒素。
2 方法与结果
2.1 鲎试剂灵敏度复核［１］ 按《中国药典》2000年版细菌内毒素检查法项下要求，进行鲎试剂灵敏度复核，同时做阴性对照管（NC）。结果鲎试剂灵敏度的测定值λc在0.5λ～2λ之间。结果见表1表1 鲎试剂灵敏度复核试验结果
2.2 供试品内毒素限值（L）的确定［１］ 甲磺酸托烷司琼注射液的拟定临床用量为：成年人（按60kg计）一次用量不超过6mg，2岁以上儿童按0.2mg/kg给药，最高可达6mg/d。参照此剂量，甲磺酸托烷司琼注射液的细菌内毒素限值按以下公式计算：
L＝K M＝5Eu/(kg·h) 0.2mg/(kg·h)＝25Eu/mg
式中L为供试品的细菌内毒素限值；K 为按规定的给药途径，临床无任何不良反应的内毒素阈剂量，注射剂的内毒素阈剂量为5Eu/(kg·h)；M 为临床人用剂量，为保证用药安全，此剂量按人用的最大剂量计算，即0.2mg/kg。根据计算甲磺酸托烷司琼注射液的细菌内毒素的理论限值可定为每1mg甲磺酸托烷司琼中含内毒素的量应小于25Eu，笔者按此限值进行其方法学研究。
2.3 干扰试验［１］ 按细菌内毒素检查法应用指导原则的要求，进行供试品干扰试验。根据计算，干扰试验的有效稀释浓度（MVC）范围为0.02～0.0012mg/ml。按照干扰预实验的操作步骤进行实验，当甲磺酸托烷司琼注射液的浓度为0.02mg/ml时，细菌内毒素在水溶液和供试品溶液中反应终点浓度的几何平均值(Es、Et ）均在0.5～2λ范围内，且Et值均在0.5～2.0Es范围内，表明该浓度下甲磺酸托烷司琼对鲎试剂与细菌内毒素的凝集反应没有干扰作用。使用两个鲎试剂厂家的两种灵敏度的鲎试剂对北京四环医药科技有限公司生产的3个批号甲磺酸托烷司琼注射液进行干扰试验，验证了方法的可行性，结果见表2、3。
2.4 甲磺酸托烷司琼注射液的细菌内毒素检查［１］ 按《中国药典》2000年版细菌内毒素检查法的要求，使用已标定合格的2批不同厂家的鲎试剂，分别对北京四环医药科技股份有限公司生产的3批甲磺酸托烷司琼注射液进行细菌内毒素检查(NPC)，并同时设立样品的供试品阳性对照管（PPC）、阴性对照管（NC）和阳性对照管（PC），验证其细菌内毒素检查的可行性。结果见表4、5表2 甲磺酸托烷司琼注射液干扰试验结果 （鲎试剂灵敏度λ=0.125Eu/ml；批号0310291）表3 甲磺酸托烷司琼注射液干扰试验结果 （鲎试剂灵敏度λ=0.25Eu/ml；批号040106）表4 甲磺酸托烷司琼注射液细菌内毒素验证试验结果 （鲎试剂灵敏度λ=0.125 Eu/ml,批号20040715）表5 甲磺酸托烷司琼注射液细菌内毒素验证试验结果 （鲎试剂灵敏度λ=0.125 Eu/ml，批号0403291）
3 小结及讨论
《中国药典》2005年版自2005年7月开始执行，其中药品细菌内毒素检查的收载品种从2000年版69个品种增加到2005年版112种，用细菌内毒素方法取代热原方法的品种有73种，这反映了药品检验的发展趋势。同时，2005年版《中国药典》中关于药品细菌内毒素检查的方法也较2000年版有较大的变动，在2000年版附录XI E细菌内毒素检查法项下，仅收载了凝胶法检查；将细菌内毒素检查法应用指导原则单独列为附录XIX F，并详细规定了限值的确定、干扰试验中对供试品（至少取3个批号）和鲎试剂（两个以上生产厂家）的要求、对标准物质和细菌内毒素检查用水（采用灵敏度为0.03Eu/ml的鲎试剂检查，24h不凝集，可用于检查）的要求，并对细菌内毒素定量测定法（浊度法和显色基质法）的基本要求做了陈述，它是建立药品细菌内毒素检查时重要参考文献；2005年版《中国药典》中［2］，附录XI E细菌内毒素检查法项下将限值的确定方法收载，该附录说明细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，前者包括凝胶限量实验和凝胶半定量实验，后者包括浊度法和显色基质法。没有单独列出细菌内毒素检查法应用指导原则，并且未列出对供试品和鲎试剂批号和厂家的限制。供试品检测时，可使用任何一种方法进行实验。当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。在2005年版中修改了对检查用水的规定，凝胶法细菌内毒素检查用水限值为0.015Eu/ml，光度测定法检查用水限值为0.005Eu/ml；在附录中明确提出，在细菌内毒素检查时，应将供试品的pH值调至6～8的范围，但对调整方法和试剂没有说明。纵观《中国药典》中有关细菌内毒素检查的变化，供试品干扰试验（回收率试验）的结果是直接决定供试品是否可以采用细菌内毒素检查的关键，量化与否只是检查方式上的改变。
综上所述，甲磺酸托烷司琼注射液在有效浓度范围内，对鲎试剂与细菌内毒素的凝集反应没有干扰作用，使用两个鲎试剂厂家的两种灵敏度的鲎试剂对3个批号甲磺酸托烷司琼注射液进行干扰试验，结果表明该方法可行。甲磺酸托烷司琼注射液可以采用细菌内毒素检查法进行质量控制，其内毒素限值可定为：每1mg甲磺酸托烷司琼中含内毒素的量应小于25Eu。
【参考文献】
1 国家药典委员会.中国药典， 二部.北京：化学工业出版社，2000，附录86；附录204.
2 国家药典委员会.中国药典，二部.北京：化学工业出版社，2005，附录85-88.
作者单位： 100035 北京，北京市药品检验所
(编辑：汪 洋)