点击显示 收起
【摘要】 神经节苷脂是促进中枢神经系统损伤后修复的特效物质，已广泛应用于治疗周围神经疾病、脑血管疾病、脊髓损伤、某些肿瘤的诊断以及保健食品的研究开发等方面。获得高纯度的神经节苷脂是其各项研究之本，由于神经节苷脂本身的复杂性，使得神经节苷脂的制备一直是学者们关注的课题，本文对目前神经节苷脂的纯化研究方法进行了概述。
【关键词】 神经节苷脂；纯化方法
神经节苷脂（gangliosides，简称GLS）是一类含唾液酸的鞘糖脂，因其最早被发现于神经节细胞而得名。具有维持细胞膜表面负电性、参与细胞识别和信息传递等多种生物学功能，尤其在促进受损神经的修复方面的特殊疗效，让千千万万的脑病患者看到了一抹曙光。近年来，GLS已广泛应用于治疗周围神经疾病、脑血管疾病、脊髓损伤、蛛网膜下腔出血、某些肿瘤的诊断以及保健食品的研究开发等方面，并且已经取得了显著成果，显示其强大的发展空间。在开展GLS的研究与应用中，首先遇到的一个课题就是如何用简便有效的方法获得高纯度的GLS。目前GLS的纯化研究方法主要有以下几种。
1 柱层析方法
柱层析方法是GLS分离纯化研究中最常用的方法，也是制备分离纯化GLS非常有效的方法。根据其层析时压力的不同可以分为常压柱层析和低压柱层析两种。
1.1 单一离子交换法［1～5］ 这种方法是Yn和Ledeen于1972年提出的，此法是利用DEAE-Sephadex这种弱阴离子交换树脂将节苷脂等酸性脂类吸附而与大量中性和两性脂类分离，然后用含盐有机溶剂将包含节苷脂在内的酸性脂类洗脱下来。即将DEAE-Sephadex A-25 装柱，将GLS粗提物溶入氯仿-甲醇中上柱，洗脱、浓缩、冷冻干燥。一般来说，离子交换树脂对GLS并无选择性，而优先吸附极性小的物质，故虽然可以分离去除水溶性杂质，但同样具有亲水基团和疏水基团的磷脂则难以去除，故磷脂污染大，含磷量高。
1.2 硅胶柱层析法［6～8］ 该法是Kawamura于1977年提出的，主要是利用硅胶对节苷脂的吸附而达到同其他脂类分离的目的。即用Iatrobeads装柱，也可用国产硅胶代替Iatrobeads，200-325目。该种层析方法能够除去蛋白质、多肽、硫酸酯、磷脂、CMP-NeuAC、CDPGalNAC等杂质。
1.3 混合柱层析 一种是将离子交换剂与吸附剂装入同一根柱子进行一次性层析，这样不仅节省了纯化步骤，也弥补了单一交换剂层析和单一吸附剂层析各自的不足，故而得到纯度较高的GLS产品。实验证实，上层用DEAE-Sephadex A-25离子交换剂，下层用吸附剂的填充方式其纯化效果最好［9］。为节约成本，仍可用国产硅胶替代Iatrobeads。另一种是将离子交换剂与吸附剂装入不同的两根柱子，相继层析［10～12］。但是这种分步层析的方法不仅操作繁琐费时，而且溶剂消耗量大，更重要的是繁琐的操作有可能造成GLS的进一步丢失，降低组织提取率。
1.4 低压柱色谱［13］ 将硅胶用四氯化碳-二氧六环2：1（V/V）匀浆，用高压泵装入不锈钢柱内（1×30cm，经输液泵依次用100ml的1：1（V/V）和9：1（V/V）的氯仿-甲醇淋洗。然后将溶于氯仿-甲醇-水65：25：4（V/V）的GLS用注射器加到柱头上，洗脱剂经输液泵淋洗、分离。根据需要可重复进行一次。采用低压柱色谱纯化制备GLS，避免了冗长的脱盐透析步骤，方法简便，同时由于色谱柱装填较紧密，用低压输液泵可以加快淋洗速度，因此，优于常压柱色谱的分离。目前该种方法应用的还比较少。
2 离心液相层析［14～17］
离心液相层析（centrifugal liquid chromatogrophy，CLC）纯化GLS是一种新方法。它的基本原理是根据混合样品中各组分质量不同在固定相和流动相分配作用不同以及所受离心力不同，从而提高分离效果。取已活化的层析硅胶170g，加氯仿-甲醇（7：1V/V）700ml，混匀，缓慢注入直径为30cm，高1cm的离心液相色谱盘中孔，转速为400r/min，待色谱盘充满硅胶后，按3倍盘体积的氯仿-甲醇-水（7：3：0.5V/V）混合液洗脱，以除去杂质至洗脱液无色为止。将预先溶于氯仿-甲醇（7：1V/V）的粗提GLS加到样品盘上，用3倍体积氯仿-甲醇-水（7：3：0.5V/V）溶液洗脱，然后改用5倍盘体积的氯仿-甲醇-水（6：4：1V/V）洗脱并收集洗脱液，浓缩，冷冻干燥。实验表明，CLC法比柱层析法上样量大，纯化时间短，洗脱液用量可节省50%，脂结合唾液酸含量可提高4%，即经CLC含量达22%，杂质（包括多肽等）由原来22%降低到9.6%。但是CLC法回收率只有90.25%，比柱层析略低。但是次纯化方法操作简便，成本低，对于批量制备仍是非常有价值的，还可以实现单质分离，是一种比较理想的分离纯化GLS的方法。
3 毛细管电泳法［18～21］
毛细管电泳法（capillary electrophoresis，CE）作为一种新技术，已经广泛用于各种生物样品组分的分离和分析。在GLS的结构中存在着亲水的糖类部分和疏水的脂类部分，在溶液中各GLS本身和GLS之间可形成混合微团，次混合微团呈扁椭圆体，平均为5.5～6.0nm，而且含双唾液酸和三唾液酸的GLS要比含单唾液酸的更易形成混合微团，不易分离，在选择含15mmol/L α-环糊精的2.5mmol/L磷酸盐缓冲液或硼砂缓冲液，电压为25kV，10s进样，195nm紫外线检测，电泳毛细管长为80cm，内径50μm，室温（24℃～26℃）作为实验条件时，能够很好地分离GLS。该方法比柱层析法、CLC法分离时间短，一般在几分钟内即可完成，操作简单。
4 微型离心柱法［22，23］
微型离心柱法为快速、少量分离纯化GLS的方法。它是用一个1ml注射器代替层析柱，外套底部放一片略小于其内径的圆形尼龙网，加入适量经双蒸水浸泡的Sephadex G-25（50～150μm）凝胶，将装好的注射器放入干燥离心管内，离心，然后将预先处理好的GLS粗提物样品加200μl双蒸水超声混匀后，加100μl于微型柱顶部，在将柱子放如另一干燥管中，离心，收集离心液。本方法省去了柱后所需的紫外检测及洗脱液的冷冻干燥等繁琐步骤，分离速度快，消耗少，回收率高，重复性好是它的明显优点。它较适用于微量组织细胞的纯化，为微量样品GLS组分的比较学研究及GLS的代谢研究提供了一个有效手段。
5 高效液相色谱法［24］
高效液相色谱法（high-performance liguid chromatography）由于具有非常高的分离能力，逐渐被发展来由节苷脂粗提物制备寡糖链均一的节苷脂。这种方法的优点是分离效果好，周期短，自动化程度高。但是，采用高效液相色谱法分离节苷脂，必须首先解决节苷脂的监测问题，常用监测方法是TLC法和紫外吸收法。由于TLC法不能连续监测，因而有一定的局限性。紫外吸收法监测时流动相大都以下面三种体系为基础：硅胶柱上的正己烷-乙醇体系，氨基柱上的乙腈-磷酸缓冲体系，硅胶或AquasilSS柱上的乙腈-异丙醇-氯化钾水溶液体系。最后一种体系可以把多唾液酸节苷脂很好地分离，成为最广泛使用的体系。
为获得纯度较高的GLS，上述几种纯化方法均可进行重复操作，但是随着步骤的增加，回收率也会急速下降，这不仅是因为每步存在GLS的损失，而且也与GLS中mono-和di-类GLS不稳定易分解或转化有关，因此，在尽可能的情况下，操作周期应尽可能短。虽然近几年来国内外许多实验室都在分离纯化GLS方面进行了探索，但是由于GLS本身的复杂性，使得GLS的制备仍存在一定的难度，由于其较难纯化，因而其价格也过于昂贵，我国目前GLS大多依赖进口，从而限制了GLS在医学以及保健食品工业中的广泛应用。因而探索一个更精练的提纯方法，降低生产成本，对促进GLS的临床应用具有非常重要的意义。
【参考文献】
1 李钦选，王素琴，王志，等.医药用神经节苷脂的制备方法.新乡医学院学报，1997，14（1）：46-49.
2 高越，尹一子，李子健，等.鹿茸中神经节苷脂的成分研究.吉林医学，2004，25（12）：37-38.
3 张新波，汤乃梅，张席锦，等.神经节苷脂纯化方法的改进.生物化学与生物物理进展，1992，19（6）：477-478.
4 刘建军，朱正美，崔肇春.人精子鞘糖脂组分的纯化与分析.男性学杂志，1994，8（2）：89-92.
5 黄如彬，杨典洱，李爱华，等.急性重复性缺氧小鼠脑神经节苷脂含量的研究. 生物化学与生物物理进展，1995，22（3）：253-256.
6 胡明，吕灿群，崔耀宗.大鼠各脏器神经节苷脂分布规律的研究.皖南医学院学报，1998，17（4）：355-356.
7 常理文，余兆楼，徐桂芸.血清中微量神经节苷脂的色谱分析.色谱，1994，12（3）：189-191.
8 徐雄心，沈霞，赵善正. 血清神经节苷脂及其结合唾液酸的分析技术研究-附初步临床应用.上海医学检验杂志，1991，6（4）：198-201.
9 张新波，崔肇春，朱正美.总神经节苷脂的简便纯化方法. 生物化学与生物物理进展，1990，17（3）：243-244.
10 高剑峰，王会文，冯万祥.猪脑组织总神经节苷脂提取纯化工艺的研究.氨基酸和生物资源，1996，18（4）：5-8.
11 高革，李东亮，马心合，等.牛脑神经节苷脂的制备及检测.新乡医学院学报，1995，12（4）：363-364.
12 崔肇春，侯卫红，朱正美.GM1在几种哺乳动物肝脏和狗红细胞中的含量及其分离纯化. 生物化学与生物物理进展，1990，17（3）：206-208.
13 郭京力，徐桂芸，常理文.低压柱色谱法分离神经节苷脂. 色谱，1992，10（3）：169-170.
14 潘颖，黄如彬，王泽生，等.离心液相色谱法快速分离纯化神经节苷脂.生物化学杂志，1994，10（4）：387-390.
15 潘颖，黄如彬，王泽生，等. 神经节苷脂制备中溶剂效率的研究.首都医学院学报，1994，15（4）：270-273.
16 潘颖，黄如彬，王泽生，等. 猪脑神经节苷脂的测定及其分析. 生物化学与生物物理进展，1994，21（4）：353-356.
17 黄如彬，潘颖，王泽生，等. 猪脑中提取高纯度神经节苷脂. 生物化学与生物物理进展，1994，21（5）：444-446.
18 黄如彬，王泽生，潘颖.毛细管电泳技术分离哺乳动物脑组织中神经节苷脂.首都医科大学学报，1996，17（3）：183-188.
19 Liu Yuanbin，Jessechan KF.High-performancc capillary electrophoresis of gangliosides.Electrophoresis，1991，12:402-408.
20 余兆楼，常理文，徐桂芸，等.高效毛细管电泳分离单唾液酸神经节苷脂.分析化学，1997，25（6）：700-703.
21 熊雄，刘松青. 神经节苷脂分离纯化过程中的共性问题.中国药业，2002，11（5）：41-42.
22 王江雁，张卫宁，王仁杰，等.微型离心柱法快速分离纯化神经节苷脂. 生物化学与生物物理进展，1997，24（1）：75-78.
23 Penesky HS.Reversible binding of Pi by beet heart mitochondrial adenosine triphosphatase.J Biol Chem，1977，252:2891-2899.
24 徐桂芸，常理文. 神经节苷脂的高效液相色谱-化学衍生方法进展.色谱，1995，13（1）：26-29.
作者单位： 310013 浙江杭州，浙江省医学科学院
（编辑：罗 彬）