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【摘要】 目的 考察δ-榄香烯体外抗肿瘤活性。方法 采用MTT法研究δ-榄香烯对HepG2、DLD-1、H292、HeLa、HL-60、SGC-7901和MCF-7等7株肿瘤细胞株生长的抑制作用，同时考察其对正常骨髓细胞和肝细胞WRL-68生长的影响。结果 δ-榄香烯对这些肿瘤细胞的增殖抑制活性呈剂量依赖关系，即细胞增殖抑制率随着药物浓度的增加而增加，在误差允许的范围内，从δ-榄香烯对7种人肿瘤细胞株的IC50分别为：Hela 细胞为157.9μM，HL-60为154.5μM，HepG2为231.6μM，H292为233.2μM，DLD-1为222.4μM，SGC-7901为323.6μM，MCF-7为287.3μM；而在低于400μM对正常细胞增殖无显著的影响。结论 δ-榄香烯体外具有有良好的抗肿瘤活性。
【关键词】 δ-榄香烯；MTT法；体外抗肿瘤活性
The study of antitumor activity in vitro of δ elemen
WANG Qian-sha,YANG Wei,LI Ming,et al.Shenyang Pharmaceutical University,Liaoning 110016,China
【Abstract】 Objective We investigated the antitumor effect of δ-elemene on several cell lines in vitro.Methods The cell prolifreration of δ-elemene were studied in HepG2, DLD-1, H292, HeLa, HL-60, SGC-7901 and MCF-7 in vitro by using MTT assay. At the same time the proliferation of bone marrow and WRL-68 were examined.Results The results showed that δ-elemene exhibited a marked antiproliferative effect on several tumor cell lines in dose- and time-dependent manners，and under the permission of standard error ranges, the IC50 of tumor cell lines were 157.9 μM, 154.5 μM, 231.6 μM, 233.2 μM, 222.4 μM, 323.6 μM, 287.3 μM, respectively, in Hela, HL-60, HepG2, H292, DLD-1, SGC-7901, and MCF-7, had little inhibiting to normal human cell line WRL-68.There was no significant inhibitory of δ-elemene on normal cells at 400 μM.Conclusion δ-elemene could inhibit significantly the tumor cell lines in vitro.
【Key words】 δ-elemene； MTT assay；antitumor activity in vitro
榄香烯（elemene）是从姜科植物温莪术的挥发油中经减压蒸馏获得的以β-榄香烯为主要成分的萜烯类化合物，属国家二类非细胞毒性抗肿瘤药物。色质谱检测证实温莪术油中含有3种榄香烯：β-榄香烯、γ-榄香烯和δ-榄香烯。傅万武等［1］已从中分离出活性成分β-榄香烯和γ-榄香烯。最近笔者成功地从榄香烯里分离出δ-榄香烯，为了初步考察其抗肿瘤活性，通过体外实验考察了δ-榄香烯对多株人肿瘤细胞的增殖抑制作用，并考察了其对骨髓细胞和正常肝细胞的抑制作用，以评价δ-榄香烯体外抗肿瘤活性。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 Hela（人宫颈癌）、HL-60（人慢性粒细胞白血病）、SGC-7901（人胃癌）、HepG2（人肝癌）、MCF-7（人乳腺癌）、DLD-1（人结肠癌）、H292（人肺癌）和WRL-68（正常人肝细胞）细胞购买于American Type Culture Collection。各株肿瘤细胞常规培养于RPMI-1640完全培养液（含10%胎牛血清、青霉素100μg/ml和链霉素100μg/ml），WRL-68培养于α-MEM培养液（含10%胎牛血清、青霉素100μg/ml和链霉素100μg/ml），置于37℃ 5%CO2孵箱中培养。
1.2 药物、试剂及仪器 β-榄香烯和δ-榄香烯均由沈阳药科大学制药工程学院提供，其含量分别为95%、96.7%； RPMI-1640（购自Gibco公司）；胎牛血清（Gibco公司）；四甲基偶氮唑盐(MTT,美国Sigma公司)；酶标仪（美国Bio-Rad, Model 550)；其余试剂均为国产分析纯。
2 方法
2.1 MTT法检测δ-榄香烯对多种肿瘤细胞株生长的影响 参照文献稍作改进［2］。悬浮细胞HL-60以1×105/ml接种于96孔板（100μl/孔）；其他6种贴壁细胞HeLa、HepG2、DLD-1、H292、SGC-7901和MCF-7用0.25%的胰蛋白酶消化，以5×104/ml接种于96孔板（100μl/well），并于5%CO2 37℃培养过夜后，加入不同浓度的δ-榄香烯（0、50、100、200、400μM）100μl/well；同时设空白对照组（0μM δ-榄香烯），复设3孔。药物作用12，24，48h后，弃培养基，每孔加入100μl含0.5mg/ml MTT的PBS(pH7.2)，培养4ｈ后，贴壁细胞快速翻板法去除培养基, 而悬浮细胞离心后弃培养基，每孔加入100μl的DMSO，微量振荡仪振荡5min，于570nｍ波长测定Ａ值。整个实验以β-榄香烯作用24h来评价δ-榄香烯对多种瘤细胞株的抗肿瘤作用。实验重复3次取平均值，结果用x±s表示，实验数据采用t检验，计算δ-榄香烯对肿瘤细胞体外增殖的抑制率（Inhibition Rate, IR%），并用SPFF11.0软件计算δ-榄香烯的半数抑制浓度IC50。
2.2 MTT法检测δ-榄香烯对正常骨髓细胞和正常肝细胞WRL-68生长的影响
2.2.1 骨髓细胞的制备 取4个月龄NIH雄性小鼠3～5只, 同时断颈处死,无菌操作取小鼠股骨骨髓细胞，用不完全RPMI-1640培养液6号针头注射器冲出骨髓细胞，静置数分钟，取上层悬液，1200r/m离心5min，加入等体积的Ficoll淋巴细胞分离液分离骨髓液中的单个核细胞，1350r/m离心35min弃上清；再用加双抗的不完全RPMI-1640培养液洗2次。台盼蓝活细胞计数后，用RPMI-1640培养体系调细胞浓度为5×106/ml（或1×106/ml）。
2.2.2 MTT法检测δ-榄香烯对骨髓细胞和WRL-68的抑制作用 WRL-68用胰蛋白酶消化，以5×104/ml接种于96孔板（100μl/well）；正常小鼠骨髓细胞以4×105/ml接种于加到96孔板中（100μl/well），置5％CO2，37 ℃培养过夜后，加入不同浓度的δ-榄香烯（0，50，100，200，400μM）100μl/well；同时设空白对照组（0μM δ-榄香烯），复设3孔。药物作用24h后弃培养基，如前述用MTT进行检测。实验重复3次取平均值，结果用x±s表示，实验数据采用t检验，计算δ-榄香烯对正常细胞体外增殖的抑制率（inhibition Rate, IR%）。
2.3 统计学处理 采用SPFF11.0软件法计算δ-榄香烯对7种肿瘤细胞株的半数抑制浓度IC50，实验结果用(x±s)表示。
3 结果
如图1～3所示，图1（a，b，c）为7种肿瘤细胞株HepG2、H292、DLD-1、SGC-7901、MCF-7、Hela和HL-60分别在δ-榄香烯作用12，24，48h时的浓度抑制曲线。图2为β-榄香烯24h对这7种瘤细胞株抑制作用的对比。图3为δ-榄香烯24h对正常小鼠骨髓细胞和人正常肝细胞的作用。
研究结果表明，经不同浓度δ-榄香烯处理的各种肿瘤细胞株的生长繁殖都受到不同程度的抑制，并呈浓度依赖性。见图1（a,b,c）。而且对7种瘤细胞株200μM的δ-榄香烯作用且均呈时间依赖性，24h δ-榄香烯的IC50分别为：Hela细胞为157.9μM、HL-60为154.5μM、HepG2为231.6μM、H292为233.2μM、DLD-1为222.4μM、SGC-7901为323.6μM、MCF-7为287.3μM。
β-榄香烯对7种肿瘤细胞株作用24h的实验结果（图2）表明，δ-榄香烯抗肿瘤作用与δ-榄香烯的抗肿瘤作用基本相当。
figure 2
研究结果（图3）表明，经不同浓度δ-榄香烯24 h处理正常肝细胞WRL-68和骨髓细胞后，与空白组比较，给药组肝细胞和骨髓细胞增殖未受到明显抑制，结果提示δ-榄香烯对正常肝细胞和骨髓细胞增殖无显著的影响。
figure 3
4 讨论与结论
MTT法是常用的检测药物体外抗肿瘤效果的方法，笔者通过体外用MTT法检测了δ-榄香烯对7种人肿瘤细胞的杀伤作用。所选用的7种人肿瘤细胞经0、50、100、200、400μM梯度浓度δ-榄香烯处理12、24、48h后，所有细胞的增殖均受到不同程度的抑制。结果表明，δ-榄香烯对这些肿瘤细胞的增殖抑制活性呈剂量依赖关系，即细胞增殖抑制率随着药物浓度的增加而增加。在误差允许的范围内，从δ-榄香烯对7种人肿瘤细胞株的IC50来看,它对SGC-7901和MCF-7这两种细胞的IC50都较大(IC50接近或超过300μM)，对其余的5种细胞的IC50则较小，其中对Hela和HL-60细胞的IC50最小分别为157.9μM、154.5μM另外，δ-榄香烯对HepG2、H292和DLD-1三株肿瘤细胞的抑制作用也较强；并且δ-榄香烯抗肿瘤作用与β-榄香烯的抗肿瘤作用基本相当［3～7］。
通过对正常小鼠骨髓细胞和人正常肝细胞抑制作用的考察，结果表明δ-榄香烯对正常细胞增殖的无显著地影响。
综上所述，笔者认为δ-榄香烯在体外具有良好的抗肿瘤活性，但其作用机制有待于进一步探讨，应该有较好的研究价值；同时还应从多方面考察其抗肿瘤功效，对其开发为抗肿瘤新药提供基础研究的依据。
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基金项目：辽宁省教育厅基金项目(编号：202043228)
作者单位： 1 110016 辽宁沈阳，沈阳药科大学(△通讯作者)
2 香港，香港中文大学
3 广东广州，广州市医药工业研究所
(编辑：石 岚)