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【摘要】 探索条斑紫菜藻胆蛋白粗提过程中高速离心作用对提纯的影响，为进一步纯化作铺垫。首先分别以高速离心法与超滤法处理藻胆蛋白盐析液，发现在对提纯贡献相近的情况下，前者受溶液量和浓度的限制更小。其次在多步盐析过程中多次插入高速离心操作，结果显示最后一次高速离心即可起到相同的提纯效果，且认为离心与盐析无法相互替代。最后研究了高速离心对脱盐液保存的影响，认为其在沉降大分子物质和变性蛋白的同时，也必然会使目标蛋白有所损失。结果显示适当的高速离心作用在藻胆蛋白粗提阶段可收到较好的效果。
【关键词】 藻胆蛋白；离心；脱盐；产率；纯度
Effects of high-speed centrifugation method on extraction and purification of crude phycobiliprotein
CAI Chun-er,HE Pei-min.Central Laboratory,Life Scientific Academy,Aquatic Product University,Shanghai 200090,China
【Abstract】 The effects of high-speed centrifugation on extraction and purification of crude phycobiliprotein were studied. High-speed centrifugation was operated firstly to purify protein, which has advantage on little limitation of quantity and concentration of solution compared to filtration. Then it was used during，several ammonium sulphate precipitation showing，that the last high-speed centrifugation was enough and unsubstitutable. Finally, high-speed centrifugation was applied to the conservation of crude phycobiliprotein, indicating，its effects on removement of denaturalized protein molecule with loss of phycobiliprotein. The results showed that high-speed centrifugation method have good effects on extraction and purification of crude phycobiliprotein.
【Key words】 phycobiliprotein； centrifugation； desalting； yield；purity
藻胆蛋白(phycobiliprotein)为蓝藻、红藻、隐藻及少数甲藻等光合作用重要辅助色素，包括藻红蛋白(phycoerythrin,PE)、藻蓝蛋白(phycocyanin,PC)、别藻蓝蛋白(allo- phycocyanin，APC)和藻红蓝蛋白（phycoerythrocyanin）。可以作为天然色素应用于化妆品、纺织品等工业，作为重要的生理活性物质应用于保健品、药品等医疗保健领域［1］、生物体内的荧光免疫临床诊断［2］、肿瘤的光动力治疗［3］。此外，最新研究发现它在光学信息存储与处理、快速光电探测、人工神经网络等方面也具有潜在的应用前景［4］。
国内外对藻胆蛋白分离纯化已有较多研究，但其成本较高或工艺复杂，致使藻胆蛋白市场价格居高不下［5］。目前比较先进的方法是采用膨化柱法粗提海藻藻胆蛋白，再过不同柱子来分离得到所需蛋白，该方法产量较高，是专为中等以上规模生产而设计的，可依然存在较多的不足，从多管藻提PE，产率低（只有0.0122%），纯度低（A565nm／A280nm<4），且只得到一种蛋白，成本较高［6］。
藻胆蛋白分离纯化第一步为粗提，其重要性往往被忽视。本实验则以紫菜为原料，主要研究藻胆蛋白粗提过程中离心和脱盐作用的影响，以提高藻胆蛋白纯度，并节省纯化成本。
1 材料与方法
1.1 材料 条斑紫菜（Porphyra yezoensis）叶状体采自江苏省吕泗紫菜栽培海区。藻体用清洁海水洗净，10℃下阴干后，密封置于-20℃冰箱保存备用。
1.2 藻胆蛋白两步盐析液高速离心法与超滤法及过柱法比较 用溶胀+组织捣碎法制备条斑紫菜粗提液［7］，加至20%硫酸铵饱和度，4℃过夜离心，上清加至50%硫酸铵饱和度，4℃过夜离心后的沉淀用等量磷酸盐缓冲液（1mmol/L，pH6.8）溶解，将所得两步盐析液均分成两组，一组通过0.22μm微孔滤膜抽滤，一组在4℃下高速离心（15000r/min，下同）30min，所得滤液和上清液测定564nm、615nm、280nm下的吸光值。
另取一份两步盐析液，用Sephadex G-25柱层析。Sephadex G-25柱为Amersham Pharmacia公司预装柱。上样前用2倍柱体积1mmoL/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）平衡，每次上样1ml，样品用同一溶液洗脱。
1.3 藻胆蛋白多步盐析过程中高速离心对纯化的影响 按1所述制备两步盐析液，所得溶液均分2份，一份直接加至10%饱和度，另一份在4℃下高速离心30min，上清也加至10%饱和度，2份均4℃过夜。未高速离心过的粗提液均分2份，一份以10000r/min在4℃下离心15min，一份在4℃下高速离心30min，高速离心过的粗提液同样均分2份，处理方法同前。上述4份所得上清均加至40%硫酸氨饱和度，4℃过夜后先以10000r/min在4℃下离心15min，沉淀用适量磷酸盐缓冲液溶解后在4℃下高速离心30min，取上清。上述各步骤所得粗提液均测吸光值。
1.4 藻胆蛋白脱盐液高速离心对纯度和产率的影响 将一份经多步盐析、透析袋脱盐、高速离心后的藻胆蛋白粗提液置于4℃下，分别在2天、8天、13天后进行高速离心，在其前后分别测吸光值。
1.5 测定方法 藻红蛋白纯度测定参考Siegelman等［8］的方法。藻红蛋白产率计算参考高洪峰等［9］的方法。吸光值用Amersham Pharmacia公司的Ultrospec 2000核酸蛋白分析仪测定。
2 结果
2.1 盐析液两种纯化方法的效果比较 两步盐析液分别经过超滤和高速离心所得两份溶液中，藻红和藻蓝蛋白的纯度均相近（图1），其中藻红纯度（A564/A280）从原先0.9增加到1.4左右，藻蓝纯度（A615/A280）从原先0.5增加到0.7左右。高速离心所得溶液的两种蛋白得率均有下降（藻红：100%～84%，藻蓝：100%～87%）。由于滤孔堵塞，只能得到小部分超滤液，其得率与前者相近（图2）。
过Sephadex G-25柱后，藻红纯度由1.1增加到1.4，藻蓝纯度由0.57增加到0.59（图3），两者得率分别为88%和69%（图4）。
2.2 高速离心对藻胆蛋白盐析过程的影响 从表1可以看出，经过盐析法（硫酸铵沉淀+普通离心）可以使藻红和藻蓝蛋白纯度上升，每次盐析后高速离心又可使蛋白纯度有所提高，4次盐析后经过1次高速离心，4份藻红蛋白纯度（A564/A280）咱1.86～1.94之间，藻蓝蛋白纯度（A615/A280）在0.84～0.91之间。
图5为经过4次普通盐析后高速离心1次，藻红、藻蓝蛋白产率变化，由图5可知，蛋白产率在高速离心后又有所降低（藻红：1.06%～0.91%，藻蓝：0.65%～0.55%）。表1 盐析过程中高速离心对藻胆蛋白纯度的影响注：横箭头：经过硫酸铵沉淀和普通离心（10000rpm，15min，4℃）；竖箭头：经过高速离心（15000rpm，30min，4℃）；斜箭头：经过硫酸铵沉淀、普通离心和高速离心破碎液 两次盐析 三次盐析 四次盐析 高速离心后步骤
2.3 高速离心对脱盐液保存的影响 由图6可知，脱盐液放置两天后，PE纯度（A564/A280）由2.619变为1.842，高速离心后回至2.593，以后的情况类似，到了第13天，高速离心后的纯度变为2.261，是最初的86.3%。由图7可知，时间越长，得率越低；且得率值随时间呈线性下降趋势；每次高速离心后的得率总是比离心前低。
3 讨论
3.1 高速离心法与超滤法对蛋白提纯的作用对比 藻胆蛋白粗提液含有分子量从小到大的各种杂蛋白。理论上认为，用0.22μm微孔滤膜可以将藻胆蛋白分子与其他一些大分子量的杂质分离，而高速离心亦可以将沉降系数大于藻胆蛋白分子的杂质优先沉淀下来，两种方法都可以提高藻胆蛋白的纯度，这一点与本实验结果一致。经过对比实验，笔者发现两者对提高纯度的贡献相近（图1）。但在操作过程中，超滤法极易发生滤膜堵塞现象，大部分未得到过滤，降低了蛋白产率，而高速离心法相对来说不受量的限制，且时间短。
3.2 高速离心对蛋白盐析过程的影响分析 由表1可知，经过硫酸铵沉淀、普通离心后的溶液，每次高速离心后藻红、藻蓝蛋白纯度均有所上升，可见后者对蛋白提纯的贡献并无可替代性。同时又发现，多次高速离心所得藻蓝蛋白的纯度（0.84，0.90，0.91）并未比只经过一次高速离心所得蛋白纯度（0.85）有大的提高，而只经过一次高速离心的藻红蛋白纯度反而最高（1.94），可见多次高速离心并无大的意义。
高速离心后产率下降（图5），表明在10000r/m下未沉降的藻胆蛋白，随着转速升高（15000r/m）部分（12.3%）也离心了下来，若再提高转速，损失的蛋白将增加。
3.3 高速离心对脱盐液保存的探讨 脱盐后的藻红蛋白溶液容易变性，高速离心后蛋白纯度上升，得率下降，推测离心去除了大部分变性蛋白，同时也带下小部分活性蛋白。
3.4 高速离心法成本探讨 高速离心机价格昂贵，以单台价格20万元计。每次使用0.5h，最大离心量200ml， 每天运转20h（40次），一年使用360天（14400次），连续使用寿命达15年（216000次），加上电费，每次使用成本仅约1元，即0.005元/ml。
过Sephadex G-25柱同样可提高蛋白纯度，但没有高速离心法明显（图1，4），而藻蓝蛋白的损失相对较多（图2，3）。Sephadex G-25预装柱（5cm）以单根价格1000元计，人工过柱，每次上样量1ml，花费10min，以每根柱使用寿命10000次计，每处理1ml量的柱成本已达0.1元，尚未考虑人力、时间和缓冲液费用。
综上所述，高速离心法可提高盐析液中藻胆蛋白的纯度，与普通盐析法形成互补，又可大量去除脱盐液中已变性蛋白质，且每次处理量大，使用成本低，与超滤法、过柱法相比优势明显，是蛋白初提过程中一种值得推荐的方法。
(致谢：十分感谢上海水产大学生命学院生物技术班级周铭同学和生物科学班级张颖等同学对本课题实验大力帮助，以及中心实验室沈伟荣、郭亭亭等老师给予的帮助。)
【参考文献】
1 Qian KX, Franklin M, Borowitzka MA.Applied Biochemistry and Biotechnology, 1993, 43 (2): 133-139.
2 Murphy JT, Lagarias JC.The phytofluors:a new class of fluorescent protein probes.Current Biology, 1997, 7(11):870-876.
3 蔡春尔,吴庆磊,徐春和,等.藻红蛋白光敏剂研究进展.生物技术通讯,2004,15(6):629-632.
4 刘维国.中华人民共和国专利.CN1417228,030514，1994，09-14.
5 王仲孚,赵谋明,彭志英，等.藻胆蛋白研究.生命的化学,2000,20(2):72-75.
6 王广策,孙海宝,马圣媛,等.CN1344723,020417.
7 蔡春尔,吴庆磊,何培民.条斑紫菜R-藻红蛋白提纯工艺研究.生物技术通讯,2005,16(5):518-521.
8 Johan AH.A1gal biliproteins: handbook of phycological method.Cambridge University Press,1978,71-79.
9 高洪峰.不同生长期坛紫菜中藻胆蛋白的含量变化.海洋与湖沼,1993,24(6)：645-648.
基金项目：上海市教委重点项目课题资助(编号：04KA01）
作者单位： 200090 上海，上海水产大学生命科学学院中心实验室
(编辑：齐 永)