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【摘要】 目的 改进5-氟尿嘧啶（5-Fu）脂质体的处方和制备工艺，提高脂质体的包封率及稳定性。方法 采用逆相蒸发法制备5-氟尿嘧啶脂质体，优化脂质体处方；考察脂质体的形态、粒径、粒径分布、包封率、Zeta 电位、体外释药等特性以及脂质体的稳定性，对脂质体进行质量评价。结果 所制得的脂质体外观较好，粒径均匀；空白脂质体平均粒径460.5nm，多分散性指数0.862，Zeta电位-4.43mV；5-氟尿嘧啶脂质体平均粒径221.3nm，多分散性指数0.644，Zeta电位-7.44mV；5-氟尿嘧啶脂质体包封率达到40.5%，体外释药起到缓慢释药的作用，且稳定性良好。结论 脂质体达到设计要求。
【关键词】 5-氟尿嘧啶；脂质体；包封率
Preparation and evaluation of 5-Fu liposomes
CHEN Qiong，SUN Wei-tong，ZHANG Du-juan，et al.Department of Pharmaceutics，Shandong University，Jinan 250012，China
【Abstract】 Objective To optimize the formulation and technology of 5-Fu liposomes，evaluate and improve the encapsulation efficiency and stability of 5-Fu liposomes.Methods The liposomes were prepared by reverse-phase evaporation technique.On the base of the single factor investigation，preparation conditions of 5-Fu liposomes were optimized.The Zeta potentials and the polydispersity were evaluated，the stabilities and the release characteristics in vitro were investigated.Results The liposomes were spherical vesicles with uniform sizes.The mean diameter of the blank liposomes and the 5-Fu liposomes were 460.5nm and 220.1nm，respectively.The polydispersity index were 0.862 and 0.644，respectively.The Zeta potential were -4.43mV and -7.44mV，respectively.The entrapment efficiency of 5-Fu liposomes were 40.5%.The stable liposomes have sustained-release effects in vitro.Conclusion The liposomes are consistent with the design supposition.
【Key words】 5-Fu；liposomes；encapsulation efficiency
长期以来，癌症始终严重威胁着人类的生命。据世界卫生组织统计，全世界每年死于癌症的患者约500万，因此癌症的预防与治疗任务十分艰巨。抗癌新药物及新剂型的研究开发具有重大的社会效益和经济效益。
5-氟尿嘧啶(5-Fu)是一种常用的抗癌药物［1，2］，主要用于治疗各种恶性肿瘤及恶性淋巴瘤转移的患者，疗效确切。但5-Fu的吸收不稳定［3］，一般均静脉给药。由于静脉注入后血中半衰期仅为7.5～10 min，消除极快，需静脉持续给药；并且由于5-Fu对机体正常组织和病理部位无选择性，有严重的骨髓抑制和胃肠道反应的毒副作用，这使临床应用受到影响。脂质体作为新型靶向给药载体系统［4］，可以提高选择性，优化药物体内分布，从而提高治疗指数，降低药物毒性。为此，将5-Fu制成脂质体制剂。对制备工艺和条件进行了研究，并考察脂质体的形态、粒径、粒径分布、包封率、Zeta 电位、体外释药等特性以及脂质体的稳定性。
1 仪器与试药
1.1 仪器 旋转蒸发器RE52-98（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；CX-250超声波清洗器（北京医疗设备二厂）；LC-10AT VP-ODS高效液相色谱仪（日本岛津）；SPD-10A VP紫外检测器（日本岛津）；80-2型离心沉淀机（国华仪器有限公司）；高压匀质机（意大利 Niro-Soaro 型号NS1001L）；ZETASIZER3000粒度分布与电势分析仪（Zetasizer3500 HS，英国Malvern公司）；ER-182A型电子天平（日本）；JY-92-Ⅱ超声波细胞粉碎机（宁波新芝科器研究所）；UNICOTM UV-2102PCS型紫外可见分光光度计。
1.2 试药 5-氟尿嘧啶（山东大学药物化学研究所）；卵磷脂（上海太伟药业），胆固醇（上海化学试剂站分装厂，批号950517）；无水乙醚（天津市广成试剂有限公司，批号20011222）；鱼精蛋白（Sigma公司 P4380）；SephadexG-50（Sigma公司 上海试剂厂分装）；甲醇、乙腈为色谱纯；氢氧化钠、磷酸二氢钾等均为市售分析纯试剂。
2 方法与结果
2.1 脂质体的制备
2.1.1 5-Fu制备工艺优化 以包封率为指标，考察药脂比、卵磷脂与胆固醇的比例、制备方法(薄膜蒸发法或逆向蒸发法)、有机溶剂(氯仿或乙醚)等因素，从而确定5-Fu脂质体的制备工艺和处方。实验结果分析表明，最佳制备工艺条件为逆向蒸发法，采用氯仿和乙醚混合溶液为有机溶剂。
2.1.2 脂质体的制备［5］ 按单因素结果摸索最佳工艺条件及处方为：逆相蒸发法制备脂质体，取卵磷脂235mg和胆固醇25mg于圆底烧瓶中，加入有机溶剂（氯仿8ml和乙醚4ml）使完全溶解后，加入 5-Fu磷酸盐缓冲液（2.5mg/ml）4ml，超声10min，在旋转蒸发仪上除去有机相（控制水浴温度在35～37℃），探针超声30s（功率80～100w），220nm滤膜过滤，得5-Fu脂质体。
2.1.3 空白脂质体制备 用4ml磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）代替5-Fu磷酸盐缓冲液，其他方法同“2.1.2”。
2.2 脂质体包封率的测定
2.2.1 紫外光谱扫描 将药物、空白辅料（相当于脂质体处方比例的卵磷脂和胆固醇）分别用甲醇-蒸馏水(5:95，V/V)混合液溶解稀释后，于200～400nm扫描，药物在267nm处有最大吸收，且空白辅料在该波长附近无吸收。
2.2.2 色谱条件 色谱柱：phenomenex C-18 柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：甲醇-蒸馏水(5:95，V/V)；柱温：25℃；流速：1.0 ml/min；检测波长：267nm；进样量：20μl。
2.2.3 标准曲线制备及精密度试验 精密称取5-Fu原料适量，用蒸馏水配制浓度分别为20.0、50.0、80.0、140.0、170.0和200.0μg/ml的一系列标准溶液，以蒸馏水为空白于267nm 处，进样液相色谱仪测定峰面积，以峰面积对浓度作图，得线形回归方程。将高、中、低3个浓度的标准溶液分别于1天内测定5次，求得日内精密度；每天测定1次，共测定5天，求得日间精密度。
结果得标准曲线方程为A=45292.96C-119773.9，在20.0～200.0μg/ml浓度范围内线性关系良好（r=0.9995）；精密度试验结果显示，3个浓度日内RSD＜0.98%，日间RSD＜1.42%。
2.2.4 脂质体包封率测定［6］ 精密吸取0.1ml 5-Fu脂质体于10ml锥形离心管中，添加0.2ml鱼精蛋白溶液(10mg/ml)，搅匀。静置3min，加入3ml生理盐水，4000 r/min离心50min。吸取0.5ml上清液于5ml生理盐水中；同时精密吸取0.1ml 5-Fu脂质体于10ml锥形离心管中，用甲醇破乳至2ml。用HPLC测定药物浓度，按公式*EE%=（W总-W游）/ W总 ×100%计算包封率。
*EE：Entrapment efficiency，计算得药物平均包封率为40.5%。
3 脂质体的质量评价
3.1 粒度分布与电势分析 取空白脂质体及5-Fu脂质体适量，分别用PBS（pH7.4）稀释10倍后，ZETASIZER3000激光粒度分布与电势分析仪测定，动态光散射软件数据处理，记录平均粒径、Zeta电位及多分散性指数。ZETASIZER3000激光粒度分析仪测定结果表明，实验制备的空白脂质体平均粒径460.5nm，多分散性指数0.862，Zeta电位-4.43mV（pH=7.5）。5-Fu脂质体平均粒径221.3nm，多分散性指数0.644，Zeta电位-7.44mV（pH=7.5）。粒度分布图见图1。
a 5-Fu脂质体粒度分布图 b 空白脂质体粒度分布图
图1 粒度分布图
3.2 初步稳定性考察 以脂质体的包封率为主要指标，考察5-氟尿嘧啶脂质体的稳定性。同批样品置于4℃冰箱中保存，放置1天、7天、15天和30天，测定脂质体的平均包封率。结果见表1。表1 不同贮存条件对脂质体包封率的影响初步稳定性研究结果表明，5-氟尿嘧啶脂质体，4℃保存30天内包封率未见显著变化，稳定性良好。
4 5-Fu脂质体体外释药动力学
采用动态膜透析法进行脂质体体外释药试验，以5-Fu磷酸缓冲液（100μg/ml）为对照。精密吸取5-Fu脂质体1ml，装入经蒸馏水浸泡处理过的透析袋内，将袋口扎紧。固定于转篮中，置于150 ml pH 7.4磷酸盐缓冲液中，按《中国药典》2005年版二部附录“小杯法”项下测定［7］。温度控制在37±1 ℃，转速为100r/min，定时吸取5ml透析液，并及时补充等量恒温的磷酸缓冲液（pH7.4）。用高效液相色谱法测定其药物释放量，同时将0.1ml的5-Fu脂质体用甲醇破乳后测定脂质体中的5-Fu含量作为总药量W，根据下式计算累积释放量和累积释放百分率。
Qn=CnV0+∑n-1 i=0CiVi 累积释放百分率(%)=Qn/W×100%
其中：Qn为各时间点的累积释放量，Cn为各时间点的实测药物浓度，V0为溶出介质的总体积，Vi为每次取样体积，Ci为i时刻各取样点的实测药物浓度，W为脂质体中的总药量。
时间-累积释放曲线见图2。
图2 5-Fu脂质体的体外释放曲线
表明，5-Fu原料药释药较快，1.0h药物已基本全部释放，累积释药百分率为99.46％；而5-Fu脂质体2.5h时达最大为98.6%，基本释放完全。
5 讨论
(1)工艺筛选过程中考虑到5-Fu为水溶性的药物，故采用逆相蒸发的方法制备脂质体。根据文献和预实验结果，以包封率为指标，经单因素考察选择5-Fu脂质体处方组成中卵磷脂与胆固醇的质量比为9.5∶1，水相与有机相的比例为1∶3时，制备的脂质体外观形态规则，粒径分布窄，且稳定性也较好。
(2)药脂比对脂质体的外观和包封率影响也较大，比例过大药物容易析出，不能制成5-Fu脂质体，且包封率不高；比例过小制得的脂质体外观不均匀，颗粒卵磷脂与胆固醇的比例对包封率的影响是：随磷脂比例增加，5-Fu脂质体包封率增加，当磷脂与胆固醇的比例为9.5/1时，包封率最高。
(3)体外释放结果表明，5-Fu脂质体释药缓慢，与游离药物相比，延长药物的释放时间。这是因为脂质体内相的药物要跨越脂质双层才能进入释放介质，脂质体对内相药物的释放起到了缓释作用［8］。
(4)常规测定脂质体包封率的方法其测定机制是基于分子大小或密度差异进行的，一般较难将脂质体与药物晶体和(或)脂质体碎片分离，且对于难溶性游离药物存在回收率低的缺点，影响包封率测定。试验采用鱼精蛋白凝聚法测定脂质体的包封率。所用鱼精蛋白是Sigma生产的鲑精蛋白(salmine)，约含2/3以上的精氨酸。精氨酸是一种含有胍基的碱性氨基酸，带正电，正是由于这些带有正电荷的胍基的大量存在，多聚阳离子肽-鱼精蛋白会与带负电或中性的磷脂产生絮凝作用，使得脂质体和游离药物得以分离，所以它是一种具有快速、用量少、针对脂质体或纳米粒电荷性质的凝聚离心法。
【参考文献】
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7 王健松，朱家壁，吕瑞勤，等.肺靶向阿奇霉素脂质体的制备及其在小鼠体内的分布.药学学报，2005，40(3):274-278.
8 张青，朱家壁，邱丽梅.盐酸左氧氟沙星脂质体的包封率和体外释放研究.中国药科大学学报，2004，35(6)：508-512.
*基金项目：山东大学药学院学生创新基金资助
作者单位： 250012 山东济南，山东大学药学院药剂教研室(Δ通讯作者)
(编辑：汪 洋)