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【摘要】 目的 建立抗肾综合征出血热病毒单克隆抗体纯化工艺，研制出特异性治疗肾综合征出血热的单抗制剂。方法 采用清洁级Balb/c小鼠分别制备3G1、3D8腹水单抗，用正辛酸沉淀、离子交换层析、硫酸铵盐析等适宜的方法进行腹水单抗的分离纯化。结果 经分离纯化后，单抗IgG纯度>95％，IgG单体纯度>95%，每毫升腹水可收获纯化的单抗3.0mg，回收率>50%，采用微量细胞培养中和试验检测抗体中和效价>1:12800～1:25600，无鼠源性病毒污染，残余骨髓瘤细胞（SP2/0）DNA<100pg/剂量；按照国家颁布的《人用鼠源性单克隆抗体制造及检定规程》，连续中试制备３批制剂，经全面检定符合临床研究的标准。结论 建立了2株单抗分离纯化的中试工艺。
【关键词】 肾综合征出血热；单克隆抗体；分离纯化
Study on purification of monoclonal antibody against HFRS virus for therapeutic application
ZOU Chang-yong，LEI Ji-jun，YU Yuan-xiang，et al.Wuhan Institute of Biological Products，Wuhan 430060，China
【Abstract】 Objective To establish the methods for purification of monoclonal antibody(mAb) against Hemorrhagic fever with renal syndrome(HFRS) virus.Methods The mAbs were extracted and purified from murine ascetic fluid by octanic acid precipitation，ammonium sulphate precipitation and ion-exchange chromatography.Results The established cell banks were free from bacteria，mycoplasma and murine virus contamination.3.0mg mAb was extracted from 1ml ascetic fluid.The protein purity and recovery rate of purified mAbs were over 95% and 50%，respectively.The neutrilizing titer of mAb varied from 1:12800 to 1:25600，The residual DNA was lower than 100pg/dose.Conclusion The established purification methods were suitable for the large-scale production of mAbs for therapeutic application.
【Key words】 hemorrhagic fever with renal syndrome（HFRS）； monoclonal antibody(mAb)；purification
肾综合征出血热（Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）是由汉坦病毒(HV)引起，由鼠类等传播的一种急性自然疫源性疾病，分布于亚、欧、非洲和美洲32个国家和地区，主要集中在亚欧部分国家。我国是世界上肾综合征出血热疫情最严重的国家，卫生部长期间都将肾综合征出血热列为重点研究和防治的传染病之一。汉坦病毒是肾综合征出血热的始动病因，因而早期清除患者体内病毒对减轻病理损害、阻断病情发展有重要作用［1，2］。人用单克隆抗体为新型高特异性生物制品，为研制早期特异性治疗肾综合征出血热的单抗制剂，本研究采用分泌对汉坦病毒具有高中和活性、高血凝抑制活性及对病毒感染动物具有良好保护作用的特异性单抗的2株杂交瘤细胞［3］制备小鼠腹水单抗，并对2株腹水单抗的纯化工艺进行了研究。按照《人用鼠源性单克隆抗体制造及检定规程》的要求［4］，连续中试制备了3批制剂。
1 材料与方法
1．1 杂交瘤细胞株 分泌抗汉坦型肾综合征出血热病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株3D8、3G1，由第四军医大学微生物教研室建株并提供。抗体亚类均为IgG1。
1．2 细胞库的建立 参照《人用鼠源性单克隆抗体制造和检定规程》建立了种子细胞库和生产细胞库。并进行细菌、霉菌、支原体及鼠源性病毒的检测。
1．3 腹水单抗的制备 清洁级BALB/C小鼠预先于腹腔注射降植烷0.5ml/只，7～14天于腹腔接种杂交瘤细胞３～５×105cells／只，一般7天左右开始出现腹水，收集腹水，2500转／min离心30min，收集中间层透明液体，分别得到3D8和3G1腹水单抗。
1．4 腹水单抗的分离纯化 3D8、3G1两株细胞制备的腹水单抗分别经正辛酸沉淀、离子交换层析、硫酸铵盐析等适宜的方法分离纯化，并将建立的方法进一步放大到中试规模，连续制备三批单抗制剂。
1.5 抗体纯度的检测 （1）电泳纯度：用非还原SDS-PAGE法，经扫描仪扫描，纯度应在95%以上；（2）HPLC法：多聚体应≤10%。
1．6 抗体回收率 根据腹水总蛋白含量及IgG所占百分比计算腹水中IgG蛋白含量，然后根据纯化后的IgG蛋白含量计算回收率。
1．7 抗体活性的检测 采用空斑减少中和试验或微量细胞培养中和试验测定单抗的中和效价。
1．8 残余DNA含量的检测 用DNA分子杂交法测定，每支制剂残余DNA含量应＜100pg。
2 结果
2．1 细胞库的建立 杂交瘤细胞株3D8和3G1原始细胞库，通过中国药品生物制品检定所全面检定，未见细菌、霉菌、支原体及鼠源性病毒污染。在此基础上，建立了种子细胞库和生产细胞库，并进行了外源因子检定，结果均符合要求。见表1及图1。
2.2 腹水单抗的分离纯化及抗体纯度 3D8和3G1腹水单抗原材料经鼠源性病毒检测及抗体活性检测合格后，经过分离纯化方法比较实验，建立了各自的纯化方案和工艺条件，抗体活性检测结果表明所建立的纯化方法对抗体活性没有影响，SDS-PAGE检测纯化的单抗IgG纯度>95%（3G1株见图2、图3，3D8株见图4，图5），HPLC检测单抗单体、双体、多聚体含量，结果单体含量>95%。表1 杂交瘤细胞3D8和3G1细胞库外源因子的检查
在IgG纯度合格的基础上，根据3D8和3G1单抗蛋白浓度，将两株单抗稀释、合并、分装，冻干。进行半成品和成品检定。合并前后单抗IgG电泳纯度均大于95%（见图6）。表2 纯化过程单抗总回收率
2．3 单抗回收率 按2株单抗各自的工艺分离纯化后，单抗总回收率>50％，从每毫升腹水中获得的单抗IgG约为3.0mg。见表2。
2．4 单抗中和效价 微量细胞培养中和试验效价为1：12800～1：25600。
2．5 残余DNA含量 残余骨髓瘤细胞DNA含量均<100pg/剂量。结果见图7。
3 讨论
为确保产品达到治疗用单抗的质控要求，我们对单抗的分离纯化工艺进行了深入研究。根据目标单抗的各项理化性质，考虑到纯化工艺的经济实用性，先后比较了正辛酸沉淀、硫酸铵沉淀、凝胶过滤、阳离子交换层析、阴离子交换层析、亲和层析、超滤等多种分离纯化方法对实验结果的影响。
以上方法各有其优缺点。其中，正辛酸-硫酸铵两步沉淀法［5］能有效地分离纯化单抗，成本低、操作简单、易于放大，但终产品纯度一般难以达到95%。本研究经多次试验，优化操作过程，纯度可达到90%以上，与其他纯化方法结合使用，经过进一步精制提纯，有望解决纯度问题。离子交换层析条件温和、分辨率高、流速快、重复性好、容量大、易于线性放大，成为研究的重点。我们在层析介质的选择、上样、洗脱条件的控制、几种纯化方法的组合、操作过程的质量控制及生产的可持续进行等方面做了大量研究，分析了多种条件，最终将辛酸－硫酸铵沉淀及离子交换层析这两种方法组合应用，确定了单抗3D8和3G1的分离纯化方案。
用该方案研制的抗肾综合征出血热病毒单抗制剂已通过了国家药品监督管理局组织的新药审评，被批准作为I类新生物制品进行临床研究。现已完成各期临床研究。
(本文图片见封三)
（致谢：抗体中和效价测定由第四军医大学微生物学教研室徐志凯主任、王海涛副教授完成，特此致谢）
【参考文献】
1 杨为松.肾综合征出血热.北京：人民军医出版社，1999.
2 全国流行性出血热防治方案.中华人民共和国卫生部，1997年2月4日.
3 卫立辛，汪美先.应用McAb和免疫血清对不同HFRS病毒株感染乳鼠保护作用的比较.单克隆抗体通讯，1990，6(2)：18-21.
4 新生物制品审批办法.1999年5月1日起施行，附件四：《人用鼠源性单克隆抗体质量控制要点》.
5 Michella M M，Parkinson A.A simple，non-chromatographic procedure to purify immunoglobulins from serum and ascites fluid.J Immunol Methods，1987，96:271-274.
*基金项目：武汉市重大科技计划项目资助(编号：20016001010)
作者单位： 430060 湖北武汉，武汉生物制品研究所
(编辑：齐 永)