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应用生物反应器无血清培养杂交瘤细胞生产治疗用WuT3单抗的工艺(pdf)
【摘要】 目的 建立用生物反应器无血清大规模培养WuT3杂交瘤细胞生产体内治疗用单抗的工艺。方法 将WuT3细胞适应于无血清培养液中,并在方瓶及3.5L、14L、75L生物反应器中逐级放大培养。结果 细胞能适应无血清培养，培养规模能成功放大到75L规模，细胞浓度达1.5×106/ml,培养上清中单抗浓度>50μg/ml，达到含10％小牛血清（FCS）培养液培养的水平。在整个放大培养过程中细胞能稳定分泌单抗，细胞株支原体检测为阴性。收获的单抗活性及热原检测均合格。结论 建立了一套无血清培养杂交瘤细胞生产治疗用单抗的工艺，适于规模化生产。
【关键词】 生物反应器；无血清培养液；杂交瘤细胞；单克隆抗体
Technological procedure on no serum cultivation of WuT3 hybridoma cells in bioreactor for production of therapeutic mAb
ZOU Chang-yong,ZHAN Qian,LENG Wu-jun,et al.Wuhan Institute of Biological Products,Wuhan 430060,China
【Abstract】 Objective To establish the technological procedure on large-scale cultivation of WuT3 hybridoma cells in bioreactor for production of therapeutic mAb. Methods WuT3 hybridoma cells were cultured in SFM in flask and gradually scaled up to 3.5L,14L and 75L bioreactor. Results WuT3 hybridoma cells can be cultured in flask and 75L bioreactor.The cells density and mAb concentration in harvest supernatant were 1.5×106/ml and 60μg/ml,respectively,which were similar to those in 10%FCS.The cells were stable and were negative in mycoplasma test.The pyrogen test and activity of the harvest mAb were qualified. Conclusion The procedure on large-scale cultivation of WuT3 hybridoma cells in SFM for production of therapeutic mAb was successfully established.
【Key words】 bioreactor；serum-free medium(SFM)；hybridoma cell；mAb (monoclonal antibody)
随着生物技术的飞速发展，单克隆抗体技术在诊断和治疗中应用日益广泛，含血清培养基的应用会面临越来越多的问题。当前生产生物制品（如病毒疫苗和重组细胞因子）都不免要加入动物血清等组分，以促进细胞生长增殖。这类外源物质对人体有潜在的危害性，而在产品的后处理过程中要完全除去有一定困难，更为担心的是因为动物血清而污染的外源因子。这些与制品安全性有关的问题已引起国内外的广泛关注，并致力于寻求解决方案。目前单抗的生产主要有体内法和体外法，随着动物细胞培养技术的发展，体外大规模培养生产单抗正成为主流。我们在成功地将WuT3杂交瘤细胞适应至无血清培养液的基础上，将WuT3细胞逐级放大到3.5L、14L、75L生物反应器中进行无血清培养，建立了大规模培养工艺。
1 材料与方法
1.1 细胞株 抗人T淋巴细胞CD3抗原杂交瘤细胞株WuT3，分泌单抗亚类为IgG2a,用于临床上肾移植病人抗排斥反应。由武汉生物制品研究所建株［1］。
1.2 培养液 基础培养液为RPMI1640,添加卡那霉素100μg/ml,不同浓度的小牛血清；添加无血清培养液（serum-free medium,SFM）添加剂（由华东理工大学提供）。用CO2调pH至7.0以下，0.22μm微孔滤膜除菌过滤。
1.3 生物反应器 3.5L、14L、75L系列生物反应器（瑞士Cheamap公司）。
1.4 细胞的无血清培养 经方瓶适应无血清培养的WuT3细胞，接种到3.5L生物反应器中，采用批式培养及半连续培养，建立了WuT3细胞在3.5L生物反应器中无血清半连续培养工艺，并放大到14L、75L生物反应器中进行无血清半连续培养。对无血清连续培养过程中WuT3细胞及其分泌抗体能力的稳定性进行研究。
1.5 培养上清的收获 经离心，去除细胞，收获含单抗的上清。
1.6 单抗浓度的测定 用琼脂糖免疫单扩散法检测单抗浓度。
1.7 单抗活性测定 间接免疫荧光法，PBL荧光阳性率达66％±9％为合格。
1.8 热原监测 用鲎试剂（LAL）监测配制培养液用水、配制的培养液、收获的培养上清中的热原。
2 结果
2.1 WuT3细胞在3.5L生物反应器中的分批式培养 参照WuT3细胞在含血清的培养液中培养的工艺条件，在3.5L生物反应器中无血清培养WuT3细胞。结果如表1。
结果表明WuT3细胞在无血清培养基中能适应生物反应器培养，细胞浓度、细胞活率、抗体浓度和抗体活性均达到含血清培养的水平。
2.2 WuT3细胞在3.5L生物反应器中的半连续培养 在3.5L生物反应器中进行了批次培养和半连续培养的比较，结果如表2。表1 WuT3细胞在无血清和有血清生物反应器培养中的培养表2 两种培养方式的比较 通过对两种培养方式的比较，发现半连续培养虽然最大细胞浓度比批次培养低但抗体产量和抗体活性结果一致，且半连续培养能及时补充细胞所需的各种营养成分，同时及时排出代谢产生的铵，降低铵的积累浓度和细胞分泌的各种毒性物质，有效地抑制了细胞的凋亡，促进了细胞的生长，维持抗体的分泌，并可不断地收获培养上清，明显提高培养上清的收获率，半连续培养更适合中试规模和大规模生产。
2.3 WuT3细胞在14L生物反应器中的半连续培养 根据上述培养方式的结果，我们利用14L生物反应器在体外通过半连续培养方式在一个多月的时间内连续收获无血清培养上清150升，根据细胞在无血清培养基中的生长曲线和抗体产生动力学，当细胞浓度达到(1.2～1.7)×106 cells/ml时，就收获一部分上清同时补加新鲜无血清培养基，放液补液后细胞浓度控制在(4.0～5.0)×105cells/ml,这样一方面补充了细胞生长和抗体分泌所需的各种营养成分，另一方面降低了影响细胞的毒性物质。14L生物反应器的收获曲线见图1。
图1 14L生物反应器半连续培养曲线
2.4 WuT3细胞在75L生物反应器中的半连续培养 将14L生物反应器半连续培养工艺放大到75L生物反应器中进行无血清半连续培养，可以重复14L生物反应器中无血清培养的结果。收获的培养上清中单抗活性合格，热原质检测为阴性（LAL试剂检测）。
2.5 WuT3细胞及其分泌抗体的的稳定性 WuT3细胞在SFM经过方瓶培养和生物反应器放大培养，连续培养3个月后，对细胞染色体胞核学及细胞分泌抗体能力的稳定性进行了研究分析，以刚复苏的种子细胞作为对照，结果如表3。表3 WuT3细胞的生长和抗体分泌的稳定性结果表明WuT3细胞在SFM中经过方瓶培养至生物反应器逐级放大培养3个月后，细胞仍保持稳定，且仍能稳定分泌单抗。
3 讨论
用生物反应器培养动物细胞通常有3种方式：（1）批次培养；（2）半连续培养；（3）连续培养。据文献报道［2］，用生物反应器批式培养杂交瘤细胞在收获时，凋亡细胞占总细胞数的90％以上，培养液中谷氨酰胺、葡萄糖的大量消耗及代谢产物铵的大量积累是诱导凋亡的主要原因。我们在生物反应器中采用半连续培养可以及时改善细胞的代谢环境，有效地抑制细胞凋亡。表明建立的半连续培养工艺适于杂交瘤细胞的大规模无血清培养。
WuT3细胞在生物反应器中的无血清培养，从细胞浓度、单抗产量、细胞稳定性来看，达到了含血清培养的结果。无血清培养较含血清培养单抗产量略有提高，可能与无血清培养液渗透压的提高有关。
（该研究通过了国家“九五”攻关验收会，并被认定为国家“九五”攻关科技成果）
【参考文献】
1 史良如，陈善华，王志友，等.武汉（Wu)系列抗人T细胞及其亚群的单克隆抗体.生物制品学杂志，1998，1（1）：27.
2 Singh RP,Al-Rubeai M,Gregory CD,et al.Biotechnol Bioeng,1994,44(6):720.
基金项目：“九五” 国家重点科技攻关项目部分工作(96-C02-03-05)
作者单位：430060 湖北武汉，中国生物技术集团公司武汉生物制品研究所
(编辑：罗 彬)