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HCV核心区基因的截短及其表达

来源:中华医药杂志
摘要:HCV核心区基因的截短及其表达(pdf)【摘要】目的高效稳定地表达HCV的核心抗原。方法设计一对特异性引物,以含HCV全长基因的质粒pBRTM/HCV1-3011为模板,扩增出HCV截短的核心抗原(1-120aa)的基因,克隆于表达载体pGEX-4T3,并转化于大肠杆菌BL21,IPTG诱导HCV截短的核心抗原的表达,表达产物经过SDS-PAGE,Western-b......

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     HCV核心区基因的截短及其表达 (pdf)

    【摘要】  目的  高效稳定地表达HCV的核心抗原。方法  设计一对特异性引物,以含HCV全长基因的质粒pBR TM/HCV1-3011为模板,扩增出HCV截短的核心抗原(1-120aa)的基因,克隆于表达载体pGEX-4T3,并转化于大肠杆菌BL21,IPTG诱导HCV截短的核心抗原的表达,表达产物经过SDS-PAGE,Western-blot,ELISA等一系列鉴定试验进行了分析。结果  成功地构建了HCV核心抗原高效稳定表达的重组质粒,表达产物具有高度特异性和良好的抗原活性。结论  该抗原的获得为研制诊断用HCV抗原奠定了基础。

    【关键词】  HCV;核心区基因;截短;表达

      Truncation and expression of HCV Core gene

    PENG Xiang-bing,SANG Ai-jun,HUANG Shi-he,et al.Wuhan Institute of Biological Products,Wuhan 430060,China

    【Abstract】  Objective  To express HCV Core antigen hightly and stably.Methods  A pairs of specific PCR primers were designed and synthesized.Truncated HCV Core gene was amplified from the plasmid pBR TM/HCV1-3011 by PCR.The gene fragement was cloned into pGEX-4T3,then transformed to E.coli BL21and expressed under induction of IPTG. The expressed product was analyzed by SDS-PAGE,Western-blot and indirect ELISA,respectively.Results  A recombinant plasmid pGEX-TP1.1for stable and hight expression was constructed successfully. The expressed product showed high specificity and good antigenicity.Conclusion  The expression of truncated HCV Core antigens laid a foundation for development of HCV diagnostis use antigens.

    【Key words】  HCV;Core gene; Truncation; expression

    丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)的核心蛋白是HCV蛋白中抗原性强且保守性较好的区段,核心抗体出现时间早,大约于感染后8~12周即可检出,且持续的时间长,阳性率高,是HCV诊断必不可少的抗原之一[1]。为了研制HCV 诊断用抗原,最初构建了含HCV全长核心基因(Core)的重组表达质粒,但该质粒表达不稳定。参照有关文献[2~4],笔者将HCV 的核心基因截短,构建了重组表达质粒,该质粒能够高效稳定地表达,现将结果报告如下。

    1  材料与方法

    11  实验材料  含HCV全长基因的质粒pBR TM/HCV1-3011由武汉大学生命科学学院叶林柏教授惠赠;pGEX-4T3购自Amersham Biosciences公司;pGEM-T载体为Promega公司产品;大肠杆菌JM109,DH5α和BL21均由武汉生物制品研究所(以下简称为武汉所)诊断用品室保存。限制性内切酶、T4DNA连接酶及TaqDNA聚合酶为Fermentas公司产品;凝胶回收试剂盒为QIAGEN GmbH公司产品;序列分析由宝生物工程(大连)公司完成。IPTG购于Fermentas公司;GST融合蛋白纯化试剂盒为Amersham Biosciences公司产品;鼠抗HCV Core抗原和NS3抗原的两种单克隆抗体购自ViroStat公司;HRP标记的羊抗鼠IgG为Novo Gene Bioscience公司产品;DAB浓缩显色液为华美生物工程公司产品;ELISA所用试剂,除抗原外,均为武汉所的HCV抗体诊断试剂盒的组份;标化血清由武汉所诊断用品室根据第5代HCV-Ab国家参比品(Panel)标定的血清 样品。

    12  引物的设计与合成  根据pBRTM/HCV 1-3011全长基因序列,设计扩增HCV截短的(1-120aa)核心抗原基因片段的特异引物。

    上游引物(L):5’G  ACG  CGT  GGA  TCC   BamH I  ATG  AGC  ACG  AAT  CCT  AAA  CC 3’

    下游引物(R):5’GTC  CGC  CGA  ATT  CGA   EcoR I  ACT  ACC  CAA  ATT  GCG  CGA 3’

    上游引物L5’端加了限制性内切酶BamH I酶切位点,下游引物R5’端加入限制性内切酶EcoR I酶切位点。以上引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

    13  PCR扩增  以pBRTM/HCV 1-3011为模板,用上述引物扩增出截短的HCV Core区基因片段,取5μl进行10%琼脂糖凝胶电泳。从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶,按照DNA凝胶纯化试剂盒操作步骤纯化回收目的片段。

    14  表达质粒的构建  纯化的目的基因片段,经T4DNA连接酶与pGEM-T载体连接,转化感受态JM109,筛选出阳性克隆,提取质粒后,经BamH I/EcoR I 双酶切反应,回收酶切产物,经T4DNA连接酶与经同样双酶切的pGEX-4T3连接,转化感受态DH5α,提取质粒后,经BamH I/EcoR I 双酶切鉴定,筛选出含目的基因片段的阳性克隆,并测序,再将阳性克隆的质粒转化感受态BL21。

    15  融合蛋白的诱导表达  将含有目的基因重组表达质粒pGEX-TP11的BL21菌株,接种于含100μg/ml氨苄青霉素的2YT培养基中,37℃培养过夜后,按1:100比例转种于新鲜2YT培养基中,继续培养至对数生长期(A600=05~07),加IPTG至终浓度为1mmol/L,诱导4~5h,取菌体用于SDS-PAGE分析。

    16  融合蛋白的纯化  将诱导表达的菌体超声破碎后,包涵体经洗涤,8mol/L尿素溶解,稀释复性,加50%预处理的亲和层析介质Glutathione Sepharose 4B,按试剂盒说明书进行纯化。

    17  Western-blot分析  纯化的嵌合抗原,经SDS-PAGE电泳后,转移至硝酸纤维素膜上,按文献提供方法进行电泳转移[5]。一抗分别为1∶30倍稀释的鼠抗HCV的Core抗原和NS3抗原的单克隆抗体,二抗为HRP标记羊抗鼠IgG,DAB显色。

    18  HCV标化血清的鉴定  用包被缓冲液稀释纯化的融合蛋白至3μg/ml,包被微孔板,每孔100μl,4℃过夜,充分洗涤后,每孔加200μl封闭液,4℃过夜,充分洗涤后加入按1∶10 稀释的HCV标化血清。37℃孵育30min,充分洗涤后加入抗人IgG酶结合物,37℃孵育30min,充分洗涤,加显色底物显色10min,加入50μl 2mol/L硫酸终止反应,在酶标读数仪上测定A450值。

    2  结果

    21  PCR扩增产物的鉴定  引物L、R设计扩增的片段长394bp,以质粒pBR TM/HCV1-3011为模板,用引物L、R扩增的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析,可见扩增的产物为约400bp的DNA片段,见图1,大小与预期设计相同。

      22  克隆质粒的双酶切鉴定  HCV截短的(1-120aa)核心抗原(P11)基因克隆到载体pGEM-T上后的克隆质粒pGEM-TP11,经BamH I/EcoR I双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳后,结果可见pGEM-TP11酶切产物大小约为400bp和3kbp左右的DNA片段,与预期结果相同,见图2。

    23  重组表达质粒的双酶切鉴定  从转化的DH5α中提取重组质粒pGEX-TP11,用BamH I/EcoR I双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳分析,可见表达载体pGEX-4T3(约5kbp)及TP11(约400bp)基因两个片段,大小与预期设计的相同,见图3。

    24  重组表达质粒的序列测定  测序结果表明pGEX-TP11中目的基因除了第68位氨基酸残基密码子由GCG(丙氨酸)突变为GCA(丙氨酸)为同义突变之外,其余序列与模板相同。

    25  重组融合蛋白的诱导表达  将经鉴定过的表达质粒pGEX-TP11, 转化感受态BL21,挑取阳性克隆,经常规诱导表达后,取菌体作SDS-PAGE分析,结果显示,目的蛋白为相对分子量约40kD rGST-P11融合目的蛋白(Lane2),与预计的表达产物分子量大小相符。SDS-PAGE凝胶经扫描分析表达产物占菌体总蛋白量的236%,结果见图4。

    26  纯化表达产物鉴定  含重组质粒pGEX-TP11的表达菌,经大量诱导培养后进行表达产物纯化,纯化过程中收集的各种样品进行SDS-PAGE分析。表达菌超声破碎后收集的上清和沉淀中均可见大量的约40kD rGST-P11融合目的蛋白(Lane1、2),说明融合蛋白部分是以可溶形式表达,部分是以包涵体的形式表达;包涵体经尿素溶解后的上清有大量的目的蛋白,沉淀中有少量目的蛋白(Lane3、4),说明包涵体已大部分溶解;表达菌超声破碎后收集的上清与50%预处理的亲和层析介质Glutathione Sepharose 4B孵育后上柱,收集的流出液中可见少量的目的蛋白(Lane5),说明大部分目的蛋白已被Glutathione Sepharose 4B特异地吸附,而收集的PBS洗柱液可见少量目的蛋白和GST条带(Lane6、7);收集纯化rGST-P11只可见一条约40kD目的蛋白带(Lane8),凝胶经扫描分析,其纯度为938%,结果见图5。

    27  表达产物Western-blot分析  纯化的重组融合蛋白rGST-P11,经SDS-PAGE电泳后,电泳转至NC膜,进行Western-blot分析,结果为重组融合蛋白rGST-P11只与鼠抗HCV Core抗原的单克隆抗体起反应,在分子量约40kD位置出现反应区带(Lane1),而与鼠抗HCV NS3抗原的单克隆抗体不起反应,无任何区带(Lane2),见图6。

    28  HCV标化血清的鉴定  重组截短HCV Core抗原包被微孔板对41份HCV标化血清ELISA进行检测,结果23份阳性标化血清中,可检出20份,有三份(P2、 P6和P23)的A值小于Cut off值,按20/23计算,阳性检出率为86%;对18份阴性标化血清检测,均为阴性,阴性符合率100%,结果见表1。表1  重组HCV Core抗原与41份HCV标化血清的ELISA结果(略)

    3  讨论

      HCV的核心蛋白是HCV诊断必不可少的抗原之一,为了研制自己的HCV 诊断用抗原,本实验最先构建了含HCV全长核心基因(Core)的重组表达质粒pGEX- TP1,最初均有约47kD融合目的蛋白表达,含该质粒工程菌(10多株)在液氮罐内冻存一段时间后,重新诱导表达时,均不再有目的蛋白的表达。将冻存含正确序列pGEM-TP1质粒重新酶切,重新构建pGEX-TP1表达质粒,也没有目的蛋白的表达。因此,没能纯化出全长的Core抗原。据文献报道,核心蛋白所含碱性氨基酸较多,精氨酸和赖氨酸占15%。研究发现,全长型核心蛋白很难获得稳定表达,而截短型Core蛋白,通过羧基端缺失,去除疏水区对表达的影响,原核表达高效且稳定,在真核细胞中也有较高水平的表达[4]。据此,重新合成引物,将Core区截短(1-120aa),构建了重组表达质粒pGEX-TP11,获得了稳定的表达,表达量占菌体总蛋白量的236%。

      纯化的表达产物进行Western-blot分析,结果只与鼠抗HCV Core抗原的单克隆抗体起反应,而与鼠抗HCV NS3抗原的单克隆抗体不起反应,证明了其抗原的特异性良好。

      纯化的表达产物包被微孔板后,对41份HCV标化血清进行了ELISA检测, 23份阳性HCV标化血清可检测出20份阳性,阳性检测率为86%,如包被的抗原中增加NS3、NS4、NS5抗原,其阳性检测率将会大幅度增高;对18份阴性HCV内控血清检测全部为阴性,阴性符合率为100%,说明表达产物具有高度特异性和良好的抗原活性。

    【参考文献】

    1  Abdel-Hamid M,El-Dalym,El-Kaframy S,et al. Comparison of second and third-generation enzyme immunoassays for detecting antibodies to HCV.J Clin Microbiol,2002,40(2):1656-1659.

    2  金奇.医学分子病毒学.北京:科学出版社,2001,348-366.

    3  朱为,刘桂珍,史晓明,等. HCV C区基因片段的克隆、表达及纯化.中国生物制品学杂志,2001,14(1):17-20.

    4  胡刚,薛小平,董小慧,等.丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠杆菌中的表达.生物技术,2004,14(4):4-5.

    5  J.萨姆布鲁克 D.W拉塞尔著,黄培堂等译.分子克隆实验指南.北京:科学出版社,2002,1723-1726.

  作者单位:430060 湖北武汉,武汉生物制品研究所

   (编辑:余  强)

作者: 彭祥兵 桑爱军, 黄仕和, 周志军, 余 健, 余
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