他莫西芬对大鼠子宫内膜增殖和凋亡的影响

    他莫西芬对大鼠子宫内膜增殖和凋亡的影响 (pdf)

   【摘要】  目的  通过他莫西芬（tamoxifen, TAM）对大鼠子宫内膜增殖细胞核抗原（PCNA）和凋亡的影响，探讨他莫西芬导致子宫内膜病变的可能机制。方法  40只成年雌性SD大鼠随机分为四组：假手术组（SHAM组）、假手术+TAM组(SHAM+TAM组)、去势手术组（OVX组）、去势手术+TAM组（OVX+TAM组），每组10只，用药28天后，处死大鼠取子宫进行形态学检查，PCNA抗原免疫组化分析及TUNEL凋亡检测。结果  他莫西芬可以使去势大鼠子宫湿重增加，上皮增厚，基质增加，可以降低未去势大鼠子宫湿重；SHAM+TAM组PCNA阳性细胞数少于SHAM组。TUNEL凋亡检测阳性细胞给药组明显少于未给药组（P<0.05）。结论  雌激素水平会影响他莫西芬对子宫内膜的作用，他莫西芬导致子宫内膜病变的基础可能并不是促进细胞的增殖而是通过其他途径抑制细胞凋亡引起的。

    【关键词】  子宫内膜；他莫西芬；增殖；凋亡

     Effects of tamoxifen on endometrium proliferation and apoptosis of rat

    ZHANG Mei，YUAN Ben-li. Institute of Pharmacology and Toxicology, Academy of Military Medical SciencesG, Beijing 100850,China

    【Abstract】  Objective  To investigate the possible role of PCNA and apoptosis involved in tamoxifen-induced endometrium pathogenesis. Methods  Forty female SD rats were randomly assigned into four groups: sham operated group (SHAM), sham operated plus tamoxifen (SHAM+TAM), bilaterally ovariectomized group (OVX) and ovariectom plus tamoxifen group (OVX+TAM). All animals were treated with tamoxifen or solvent control for 28 days. Then animals were sacrificed and uteri were removed for histological examination, immunohistochemical detection for PCNA and apoptosis cells. Results  After tamoxifen administration, the uterus weight of ovariectomized rat was increased , while utertus weight of SHAM rat was decreased . The positive signals of PCNA are fewer in SHAM group than that in SHAM+TAM. Compared with control group, apoptosis cell number significantly decreased after treated with tamoxifen.Conclusion  Estrogen level could influence the effect of tomaxifen on endometrium. Inhibition of apoptosis but not induction of endometrium proliferation is probably involved in the effect of tamoxifen on endometrium.

    【Key words】  endometria; tamoxifen; proliferation; apoptosis

    他莫西芬（tamoxifen, TAM）是第一代选择性雌激素受体调节剂(SERM),在乳腺癌综合治疗中具有重要地位，是目前临床上应用最广泛、最有效的内分泌治疗药物，也是乳腺癌术后辅助治疗的常用药物，近来还用于预防高危人群乳腺癌的发生。自Killachey［1］等首次报告TAM治疗的乳腺癌病人发生子宫内膜癌以来，陆续有他莫西芬增加子宫内膜癌发病率的报道。1996年IARC(WHO)将他莫西芬列为致癌物。他莫西芬对子宫内膜的影响日益引起人们的关注。本研究以SD大鼠为研究对象，探讨他莫西芬对子宫内膜增殖和凋亡的影响。

    1  材料与方法

    1.1  研究对象  雌性SD大鼠（军事医学科学院动物中心提供）40只（体重180-220g），随机分为4组：SHAM组(打开腹腔找到双侧卵巢不切除)，SHAM+TAM组(假手术后给予TAM)，OVX组（行双侧卵巢切除），OVX+TAM组（双侧卵巢切除后给与TAM）；每组10只。

    1.2  实验方法

    1.2.1  实验用药及设计  他莫西芬（上海医药有限公司华联制药厂），用蒸馏水配制成5 mg/ml的混悬液。实验动物切除卵巢2周后开始给药，每天灌胃，药量为50 mg/（kg·d）,共28天。SHAM组、OVX组给予等量蒸馏水。实验结束24h后处死动物，取子宫称湿重，中性缓冲液配制的10%福尔马林固定。

    1.2.2  取材制片染色

    1.2.2.1  固定液固定24h后，双侧子宫体部取材，石蜡包埋，制成3 μm的组织切片，分别进行HE、PCNA免疫组化及原位细胞凋亡检测。

    1.2.2.2  PCNA免疫组化染色采用PV二步检测法。步骤如下：3μm厚石蜡切片，切片被覆有APES，常规脱蜡，梯度酒精脱水，然后浸入3％H2O2去离子水孵育10min，放入枸橼酸缓冲液中微波中档修复10min，冷却至室温，5％BSA室温封闭30min。多克隆兔抗PCNA抗原（原液1：1000稀释，santa cruze公司）4℃ 过夜。滴加羊抗兔IgG抗体-HRP多聚体，37℃孵育30min。每步孵育后，均以PBS缓冲液清洗3次，每次2min。DAB显色。选一张切片用PBS代替一抗，作为阴性对照。以细胞核棕黄色为阳性。

    1.2.2.3  原位细胞凋亡检测采用TUNEL检测法。TUNEL检测试剂盒购于R&D公司。实验步骤按说明书操作，DAB显色，细胞核棕黄色为凋亡细胞。

    1.3  观察方法

    1.3.1  PCNA采用OLYMPUS显微镜BX50-32H01型在高倍镜（400倍）下观察所有内膜细胞，阳性细胞换算成百分率，所有计数由专人操作。

    细胞增殖率=阳性细胞数/总细胞数×100%

    1.3.2  TUNEL检测采用与PCNA计数同样的方法计算细胞凋亡率。

    细胞凋亡率=凋亡细胞/总细胞数×100%

    1.4  统计学处理  采用SPSS11.0统计软件包，经数据转换后，进行单因素方差分析和t检验。

    2  结果

    2.1  子宫湿重及脏器系数  他莫西芬可降低未去势大鼠子宫湿重及脏器系数，但是却可以增加去势大鼠子宫湿重及脏器系数（见表1）。表1  他莫西芬对大鼠子宫湿重及脏器系数的影响

    2.2  PCNA免疫组化染色检测阳性细胞率及细胞原位凋亡检测阳性细胞率  他莫西芬在未去势大鼠中抑制子宫内膜细胞PCNA抗原的表达率,对去势大鼠无显著性影响。但无论去势与否，他莫西芬都可以显著地抑制其子宫内膜细胞凋亡率（见表2）。  表2  他莫西芬对大鼠子宫内膜细胞增殖率和凋亡率的影响

    3  讨论

    他莫西芬为人工合成非甾体类选择性雌激素受体调节剂。他莫西芬在乳腺组织表现出对雌激素的拮抗作用，但对于子宫内膜却有雌激素样作用。

    子宫湿重及其脏器系数是衡量子宫最基本的指标，本实验的结果显示，他莫西芬能降低假手术组大鼠子宫的湿重及其脏器系数，却又可以显著增加去势大鼠子宫湿重及其脏器系数。表明他莫西芬对雌激素水平不同的大鼠子宫影响是不一样的。为明确他莫西芬的这种作用，笔者进一步通过免疫组化的方法检测子宫内膜中PCNA的阳性率。PCNA为细胞周期因子的一种，无种属及组织特异性，它存在于活跃增生的细胞中，在G1晚期和S期表达，是一种比较理想的判断细胞增生的指标［2］。结果显示，在有一定雌激素水平的假手术组大鼠给药后PCNA阳性表达率低于对照组，而在去势组PCNA阳性表达率高于对照组。表明他莫西芬在有一定雌激素水平时对子宫内膜表现为雌激素拮抗作用，而在低雌激素时表现为雌激素样作用。

    细胞凋亡又称程序性死亡，是细胞“自杀”的一种主动形式。细胞的正常生长需要增殖和凋亡的平衡。肿瘤的发生不仅存在细胞增殖和分化的异常，也存在细胞凋亡的异常。他莫西芬导致子宫内膜病变的原因一直是研究的焦点，有学者认为其导致子宫内膜病变是其在子宫上表现为雌激素样作用,也有人研究表明其有基因毒性,可以和DNA发生交联导致癌变，最新还有研究表明其可以使增殖基因低甲基化导致基因改变。很少有关于其对于子宫内膜凋亡的影响及机制的研究，本实验的结果显示，无论去势与否他莫西芬均明显抑制了大鼠子宫内膜的凋亡。这与Frederique M.Poulet等对幼鼠［3］以及P.McGurgan［4］等人对人类子宫内膜息肉的研究结果有一致性。他莫西芬对子宫内膜细胞凋亡的抑制可能是导致细胞过度生长并导致最终病变的基础。

    他莫西芬可以增加绝经期服用他莫西芬妇女患子宫内膜癌的风险，但随着他莫西芬用于乳腺癌高危人群的预防用药，绝经前妇女服用他莫西芬的安全问题也日益得到关注，本实验结果显示在大鼠他莫西芬对于有一定雌激素水平的子宫内膜有雌激素拮抗作用。但是他莫西芬对凋亡抑制所造成的影响值得进一步研究。

    很多文献报道他莫西芬诱导乳腺癌细胞凋亡是它治疗乳腺癌的途径之一，但本研究表明它可以抑制子宫内膜细胞的凋亡，这可能是他莫西芬在两种组织表现出截然相反效应的关键所在，进一步研究他莫西芬抑制子宫内膜细胞凋亡途径可能会对其更好地发挥疗效减少副作用提供帮助。

    【参考文献】

    1    Killacke MA,Hakes TB，Pierce VK.Endometrial adenocarcinoma in breast cancer patients receiving antiestrogens.Cancer Treat.Rep，1985,69：237-238.

    2  孙爱军，朱蓬弟，王介东，等.绝经后补充雌孕激素对子宫内膜增生与抑制的研究.生殖医学杂志，1997，6（1）：32-36.

    3  Frederique MP,Michele LR，Paul MV. Initial uterine alterations caused by developmental exposure to tamoxifen. Repoductive Toxicology,1997，11（6）：815-822.

    4  P McGurgan LJ，Taylor  S，R Duffy,et al. Dose tamoxifen therapy affect the hormone receptor expression and cell proliferation indices of endometrial polyps?An immunohistochemical comparison of endometrial polys from postmenopausal women exposed and not exposed to tamoxifen. Maturitas，2006，54：252-259.

   作者单位： 100850 北京，军事医学科学院毒物药物研究所

　 (编辑：邓  锋)