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首页医源资料库在线期刊中华医药杂志2007年第7卷第3期

莪术油吸收机制及其口服制剂开发

来源:《中华医药杂志》
摘要:【摘要】目的莪术油及其部分单体在Caco-2细胞层模型中药物口服吸收的体外筛选及模型,是在新药开发中对药物的筛选及吸收机制研究与应用。方法莪术油及其单体Caco-2细胞模型可在体外研究药物的摄取、代谢、外排和跨细胞转运。结果药理研究表明莪术油具有抗肿瘤作用,能抑制肿瘤细胞异常增殖作用。结论......

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【摘要】  目的 莪术油及其部分单体在Caco-2细胞层模型中药物口服吸收的体外筛选及模型,是在新药开发中对药物的筛选及吸收机制研究与应用。方法 莪术油及其单体 Caco-2细胞模型可在体外研究药物的摄取、代谢、外排和跨细胞转运。结果 药理研究表明莪术油具有抗肿瘤作用,能抑制肿瘤细胞异常增殖作用。结论 莪术油吸收机制及其口服制剂在开发早期阶段对候选化合物的转运、代谢、毒性及口服特性等进行高质量的体外筛选和评价,是研制创新药物的重要环节。

【关键词】  莪术油; Caco-2细胞模型; 吸收机制

    莪术是姜科植物蓬莪术Curcuma phaeocaulis Valeton、广西莪术C. kwangsinensis S. G. Lee et C. F. Liang和温莪术C. wenyujin Y. H. Chen et. Ling的干燥根茎。其功效为行气破血、消积止痛,主治瘀血闭经、食积胀痛及早期宫颈癌,具有抗肿瘤、抗早孕、抗炎、抗菌、降酶等作用,尤其其抗肿瘤作用已引起广大研究者的重视并已在临床上得到广泛的应用。其活性成分为挥发油成分,在莪术中含量为1%~2.5%。药理研究表明莪术油具有抗肿瘤作用,能抑制肿瘤细胞异常增殖。不同品种、不同产地的莪术挥发油中,已分别鉴定出29~42种化合物,主要为萜类及倍半萜衍生物。其中的莪术醇在试管内能抑制金黄色葡萄球菌、β-溶血性链球菌、大肠杆菌、伤寒杆菌等的生长,对呼吸道合胞体病毒有直接抑制作用,对流感病毒A、A3型有直接灭活作用,临床上主要用于宫颈癌的治疗,但在空气中易氧化,光照易分解,影响其疗效;β-榄香烯对肿瘤细胞生长有直接抑制作用;临床应用莪术二酮表明对宫颈癌有较好疗效。

    1   Caco-2细胞模型

    Caco-2细胞是人结肠肠癌上皮细胞(The Human Coclon Carcinoma, 细胞Line代号:Caco-2)。其核型为四倍体,不同细胞间染色体数目有较大差异。细胞在生长至融合后有柱状突起,类似于小肠微绒毛,向培养液一侧形成刷状缘并有分化良好的紧密连接复合物。其标志酶的功能表达及通透特征与小肠类似,因而被大多数实验采用作为研究小肠表皮细胞转运和代谢的体外模型,广泛应用于新药的筛选及吸收机制的研究。

    在新药开发中,如何在早期阶段就对候选化合物的转运、代谢、毒性及口服特性等进行高质量的体外筛选,尽早作出综合评价已成为研制创新药物的重要环节。由于在新药开发中用动物实验来评估新药的吸收好坏可靠性较差。整体动物实验变异性大,建立生物样本中药物的分析方法十分耗时,周期长。因而迫切希望建立一种新的、能够快速对有活性化合物的口服特性进行筛选的体外模型代替动物模型,并且能够在新药开发的初期就筛选出有开发价值的活性化合物。Caco-2细胞模型就是在这种背景下产生的诸多体外模型中非常成功的一种模型。经过二十多年的探索,Caco-2单细胞层模型现已被大多数人认可为小分子药物口服吸收的体外筛选模型。

    1.1   Caco-2细胞模型的特点   Caco-2细胞培养模型在分析药物转运、研究药物代谢机制方面有许多优点:(1)实验条件可精确控制,所需药量很少,省时;(2)可研究抑制剂、代谢物的作用;(3)可测定药物的细胞摄取及跨膜转运,并可在有代谢状况下测定转运;(4)来源是人结肠癌细胞,同源性好;(5)细胞是极性的,可用于区分肠腔内吸收的差别。它也有一定的缺点,如:缺少黏液层及部分代谢酶;缺少细胞特异性(单一细胞构成);屏障特性与结肠上皮更相似等。大量的研究表明Caco-2细胞模型适于应用在新药开发的早期阶段。

    1.2   Caco-2细胞模型的原理   在Caco-2细胞模型中,药物的转运过程为:药物分子从Caco-2单层细胞层的肠腔一侧(AP侧)跨过Caco-2单细胞层或经由细胞间隙到达基底侧(BL侧)。药物跨过肠上皮有4条途径:(1)跨膜转运;(2)胞旁转运;(3)载体介导转运;(4)胞饮。吸收好的药物多为脂溶性,易分布于肠上皮细胞膜,大部分经被动跨膜转运。吸收差且缓慢的药物,如亲水性药物及多肽等,不易分布至刷状缘,更易于从胞间通路透过上皮。但由于刷状缘细胞面积远大于(>100倍)侧面面积,足可以补偿这一差别,所以亲水性药物跨膜转运与胞旁转运几乎相当。对于亲水性药物的胞旁转运通路,有实验证明紧密连接是其通透的限制性因素。许多Caco-2细胞模型的研究结果表明,在Caco-2细胞层主动转运途径有三条:(1)二肽载体;(2)P-糖蛋白;(3)寡肽载体。其中,P-糖蛋白介导药物外排过程,它使药物的吸收减少,抑制这一过程可增加药物的吸收。

    有研究试图把Caco-2细胞模型的通透系数与口服吸收相关联。在Caco-2细胞模型中把药物按通透系数数值的大小分级,发现通透系数的值的大小在5×10-8~5×10-6cm/s之间。吸收良好的药物的表观通透系数Papp>10-6cm/s;吸收在1%~100%间的药物表观通透系数Papp在(0.1~1)×10-6cm/s;而吸收差的药物(即吸收<1%)Papp<10-7cm/s。

    1.3   应用   目前,Caco-2细胞模型在国外主要被应用于:(1)筛选口服药物的吸收特性(此为该模型的主要应用)。①研究药物的化学结构与吸收的关系。②研究前提药物的吸收。③研究辅料对吸收的促进作用。(2)口服药物的吸收机制研究。Caco-2细胞模型可在体外研究药物的摄取、代谢、外排和跨细胞转运。Ismael J. Hidalgo等用Caco-2细胞模型研究了大分子中性氨基酸(LNAA)-苯丙氨酸(Phe)的转运,发现其从AP到BL的转运速度约是BL到AP的10倍,有证据显示AP到BL的转运是载体介导的,且Phe的转运在有叠氮盐、哇巴因存在或缺少葡萄糖时会减少。

    由于小肠内代谢也对药物吸收有影响,Caco-2细胞在药物代谢方面也有应用,已有文献总结Caco-2细胞可以产生碱性磷酸酶、二肽酶、氨基肽酶、γ-谷氨酰转肽酶、二肽酶、微粒体酶(如:P4503A4,3A5)等,已有文献对P450酶表达的调节及转染特定cDNA进行了探讨,这必将提高Caco-2在代谢方面的作用。

    2   自乳化释药系统

    自乳化释药系统(self-emulsifying drug delivery system, 简称SEDDS)是一种均一、澄清、各向同性的溶液,由油溶液和表面活性剂组成,有时也包括助溶剂。该混合物系统早年被广泛应用于农药和杀虫剂,20世纪70年代末,有人建议将其用作疏水性药物的载体,到20世纪80年代,国外在这方面的研究逐渐增多。作为一种新型的药物传递系统,SEDDS已越来越引起人们的兴趣。

    对于脂溶性或水难溶性的药物,由于其水溶性差而会出现溶出度小,口服生物利用度低等现象,从而导致药物疗效不佳。子乳化药物传递系统适用于脂溶性或水难溶性的药物,其特点是在没有水相存在的情况下,在环境温度(通常指体温37℃)及温和搅拌下能自发形成水包油乳剂。该体系为由药物、油相、非离子表面活性剂和助溶剂相互作用而形成的热力学稳定的均一溶液,一般分装于软胶囊中,口服后在胃液的水相里,由于胃蠕动和乳化剂的存在自发形成水包油型乳剂。自乳化药物传递系统制剂制备较简单,性质稳定,剂量准确且服用方便,适合大规模生产,具有很大的发展前景和应用价值。

    2.1   SEDDS的定义   SEDDS是由药物、油相、表面活性剂和辅助表面活性剂组成的均一、透明的溶液,在环境温度和温和搅拌的条件下,由于表面活性剂的作用,自发乳化形成粒子在5μm左右的乳剂。特点是药物存在于细小油滴中,能快速分布于整个胃肠道,减少了由于药物与胃肠壁的直接接触而引起的刺激:药物在油/水两相之间分配,依靠细小油滴的巨大比表面积大大提高了水难溶性药物的溶出,提高了药物的生物利用度,同时可以避免水不稳定药物的水解及药物对胃肠道的不良刺激。制备自乳化药物传递系统制剂的关键是对体系中的油相、表面活性剂和辅助表面活性剂的种类及它们之间的比例进行优化。

    2.2   处方组成   油相:早期多用中链三酰甘油(MCT),未经修饰的食用MCT作为“天然”脂质材料,具有安全的缺点,但缺点也明显,对疏水性药物溶解度差、自乳化效率低。与之相比,经修饰和水化的MCT显得更有效、具高度的流动性、溶解性和自乳化能力。更具潜力的是新的半合成中链衍生物,它们具有类似表面活性剂的两亲性,这时处方中更亲脂的表面活性剂可视为亲水的油相。

    表面活性剂:常用亲水性非离子表面活性剂,如乙氧基聚乙二醇甘油酯和Tween 80等,它们的毒性小于离子型表面活性剂,但可能在胃肠道发生转相反应。常用浓度为30%~60%(W/W),浓度过高会对胃肠道起刺激作用。不同的表面活性剂和助乳化剂组合可制得不同的SEDDS和SMEDDS。

    用目测评估方法,Pouton对一系列工业用非离子型表面活性剂做了筛选,评估与中链和长链三酰甘油产生自乳化的能力。结果显示含大量不饱和酰基链的表面活性剂最有效,而尤以HLB值大约为11的油酸酯效果最好。山梨醇酯(例如:脱水山梨醇酯85)或乙氧基三酰甘油(如Tagat TO)比乙氧基脂肪酸有效。

    助乳化剂:自乳化系统常含有超过30%(W/W)的表面活性剂,加入可口服的有机溶剂(乙醇、丙二醇、PEG等)作为乳化剂可促进溶解这些表面活性剂及药物,并能降低界面张力,增加界面膜的流动性,调剂HLB值。需要注意的是,自乳化释药系统最终常制成软胶囊或硬胶囊剂,如果含有乙醇及其他挥发性成分,则这些物质可能会穿透囊壳,降低制剂的溶解能力,导致亲脂性药物沉淀。但是如果选用无醇处方,有可能降低对那些亲脂性药物的溶解能力。因此需要作综合考虑。

    药物:SEDDS和SMEDDS中包含一定量的药物,新合成的亲水性油相和表面活性剂溶解药物的能力强于普通的植物油。加入助乳化剂也可增强对药物的溶解能力。

    加入药物后对自乳化系统的影响程度因制剂和药物而异,加入药物后可能会改变油/表面活性剂的最佳比例。处方越复杂,所得制剂越精细,自乳化也就越容易受药物影响。所以,必须进行处方前溶解度试验和相图试验。

    2.3   SEDDS的质量评价

    2.3.1   乳剂粒径   SEDDS经水稀释后所得乳剂粒子一般小于5μm,所形成微乳的粒径可通过粒径测定仪或透射电镜来测定。

    2.3.2   自乳化速率   自乳化速率是评价混合物自发形成稳定微乳或粒径均一精细的乳滴的能力的一个指标。国外文献报道,自乳化的时间虽不能正式测定,但可通过目测法观察完全分散的时间;另有文献报道,建议通过评价自乳化的速率和分散后的粒径来评价自乳化的效率,用浊度变化来测量自乳化的平衡时间。具体方法是将一个固定转速但剪切力极小的搅拌桨装在一个含有水相的玻璃自乳化池内,用微量注射器将SEDDS制剂注入水相中,通过比浊计,对整个乳化过程中散射光的强度进行测定,以散射光强度对时间(t)作图,到最大值时达到平衡,此图相当于固体制剂的溶出曲线图,可作为乳化速度的量度。散射光强度达到最大值的50%、90%时的时间t50 和t90 可作为相对乳化时间。

    2.3.3   乳剂粒子的极性   乳剂粒子的极性与乳化剂的HLB值有关,乳化剂中的脂肪酸不饱和度及链长、亲水基团的相对分子质量都会影响到乳滴的极性。乳剂粒子的极性可用疏水性药物在油/水中的分配系数(P)来衡量。

    2.3.4   药物的释放速率   在SEDDS 中,药物的释放速率由制剂在水性介质(pH1.2 或7.4)中的体外溶出实验来衡量。所选择的处方应具有最高的溶出速率。体外释药动力学实验一般采用以下几种方法:透析袋扩散法、总体液平衡反向透析法、离心超滤法、低压超滤法等。

    乳剂粒径越小,油水界面的面积越大,则自乳化所得乳剂的稳定性越好。药物从乳滴中释放的速度与粒径、极性有密切关系,可用如下公式表示:Q= f (1/ rK),其中Qt 为在不同时刻从油滴扩散入水中的药物量,r 为油滴的粒径,K 为油水分配系数,r 越小,K 越小,药物释放速率越快。

    2.4   影响SEDDS中药物口服吸收的因素   影响SEDDS 药物口服吸收的主要因素有处方、表面活性剂的HLB 值、表面活性剂和辅助表面活性剂的比例、粘度、所形成的乳滴的粒径大小和所荷电荷等。

    2.4.1   表面活性剂的HLB值   表面活性剂的HLB 值越高,微乳存在的区域越宽,溶出速率也越快,HLB值在10~15 之间的表面活性剂和具中等链长(C8~C10)脂肪酸的单硬脂酸甘油酯是最有效的。恰当地选择表面活性剂和辅助表面活性剂及其浓度,可形成最佳的自乳化处方,达到最大的体外溶出。

    2.4.2   乳剂的粒径   研究表明,乳剂的粒径与生物利用度有密切关系,国外上市的山地明SEDDS 生物利用度随粒径减小而显著上升。还有人把有效的乳化系统定义为能产生小于5μm 粒径的乳化系统。SEDDS在水中形成乳剂粒径的大小,与所选用的乳化剂系统的乳化效率有关,当必要的无限稀释对乳剂性质没有多大的影响时,用光子矫正光谱技术(PCS)测定粒径是非常有用的。

    2.4.3   乳滴荷电性质   已经证实小肠细胞内部相对于黏膜流体是负性的,当不存在主动转运溶质时,小肠保持着电位差,因此荷正电的乳滴要比荷负电的乳滴生物利用度高。最近研制的黄体酮SEDDS和已上市的环孢素SEDDS处方中,加入油胺可形成荷正电的乳滴,该乳滴被有效地粘附在荷负电的胃肠道上,有效地增加了药物的吸收。

    2.4.4   可稀释性   当水溶性的辅助表面活性剂为处方中的重要组成部分时,用水稀释时会因巨大的相行为变化从而导致药物析出,因此,每个系统的实用性将取决于它能否被稀释利用,以及在稀释时是否会丧失溶解能力。

    2.5   部分SEDDS的成分组成   见表1。

    表1   部分SEDDS的成分组成

    给药系统类型    油相    乳化剂    助乳剂    药物    药物含量

    SEDDS    甘油单油酸酯和双油酸酯的混合物    聚乙二醇甘油单酯、双酯、三酯、    -    Ontazo last ( 白三烯抑制剂)    7.5%

    SEDDS(山地明)    橄榄油    聚乙二醇甘油酯    乙醇    环孢素A    10%

    SEDDS    中链饱和脂肪酸、花生油    中链甘油单酯、双酯、Tween80、聚乙二醇-25-甘油三酯   -    Ro15=0778 (一种萘的衍生物)   5%

    SEDDS    中链饱和脂肪酸    聚乙二醇-25-甘油三酯   -    WIN 54954    35%

    SMEDDS    -    聚乙二醇甘油酯    -    吲哚美辛    4%

    SMEDDS(Neoral)    氢化玉米油    聚乙二醇甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油衍生物    甘油    环孢素A    10%

    SMEDDS(Neoral)    氢化玉米油    聚乙二醇甘油酯、聚氧乙烯蓖麻油衍生物    乙醇    环孢素A    10%

    正电荷SEDDS    油酸乙酯    Tween 80    乙醇    环孢素A    10%

    正电荷SEDDS    油酸乙酯    Tween 80    乙醇    黄体酮    10%

    SEDDS    甘油三辛酸酯    Tween 85    -    联苯二甲双羧酸酯    2. 5%

    SEDDS    来自椰子油的中链脂肪酸甘油三酯    液体大豆卵磷脂    -    降钙素    240U/ml

    3   中药软胶囊制剂

    软胶囊是指填装药物呈橄榄形或球形胶囊产品。由于胶壳中含有甘油而具有较大的弹性,所以软胶囊亦称弹性胶囊剂。包括:速效胶囊、骨架胶囊、缓释胶囊、包衣胶囊、直肠胶囊、阴道胶囊。与其他剂型相比,具备生物利用度高、含量准确、均匀性好、外形美观等特点。

    最早软胶囊剂有维生素A、D 胶丸,现在品种多达3600余种。20世纪90年代我国开发了一系列中药软胶囊品种,目前我国上市的中药软胶囊制剂有麻仁、六味地黄、藿香正气等软胶囊。

    软胶囊剂与其他剂型相比具有生物利用度高、密封性好、含量准确、外形美观等特点, 但也存在一些稳定性问题, 如贮存期内崩解不合格、胶囊内发生物质迁移等现象, 使制剂开发出现困难。

    3.1   适宜制成软胶囊剂的药物

    3.1.1   油性药物与低熔点药物   这类药物在常温下是液体或半固体, 制成制剂时常采用吸收、固化等技术处理。加入吸收剂等辅料, 将使剂型体积增大; 如在制备时进行加热干燥处理, 药物又易从吸收剂等辅料中游离渗出, 使主药损失,影响疗效。软胶囊剂是将油性药物与低熔点药物用脂溶性溶剂溶解或制成乳浊液进行填充, 省去了吸收辅料, 使制剂剂型体积缩小, 同时避免了药物渗出等问题, 且能提高生物利用度, 故对于这类药物,软胶囊剂是最合适的剂型。

    3.1.2   生物利用度差的疏水性药物   如环孢素水溶性差, 将其与油性载体制成微乳剂后装入软胶囊, 可大大提高其生物利用度。若采用其他固体制剂, 这类药物难以达到有效血药浓度。

    3.1.3   具不良气味的药物及微量活性药物   软胶囊剂能掩盖药物的不良气味已是众所周知的特点。一些微量活性药物剂量很小, 如阿洁骨化醇和骨化三醇(每粒均含药量0.25μg) 最宜制成软胶囊剂。

    3.1.4   遇光、湿、热不稳定,易氧化的药物   软胶囊的囊材由甘油、明胶等组成, 壁厚又无透气性, 是防止药物氧化的优良制剂。尤其是维生素类, 易受温度、氧、重金属等影响, 经与油混合, 用油包覆其表面, 可增加稳定性。为防止光敏性药物遇光分解, 可在囊材中加入钛白粉或氧化铁等遮光材料。为防止药物与空气接触, 可在制备过程中通入惰性气体。

    3.2   中药软胶囊的特点   软胶囊是一种较新的剂型,它适用于含有挥发性成分多的中药。其特点是:(1)纯中药制剂,不含糖,便于老人及糖尿病患者服用;(2)有效成分含量高,其最大限度提取和保留了挥发性有效成分;(3)生物利用度高,其采用先进的制备工艺,内容物为高科技萃取精华,杂质含量低,不含生药粉,更易符合卫生学指标;(4)进入胃肠迅速崩解被人体吸收,达到有效血药浓度而显效;(5)软胶囊是由压制法或滴制法制备,一次成型,全封闭剂型,避免久置后出现崩解不合格现象;(6)口感好,其掩盖了药物中挥发性成分的不良气味,便于服用;(7)服用量少,携带方便。

    3.3   中药软胶囊的技术特点   (1)适用于含挥发性成分较多的中药,内容物中的浸膏粉粒度要求低于100目;(2)制剂采用压制法,将内容物注入胶皮中压制而成;(3)制剂难点(漏油现象),主要与浸膏粉的粉碎粒度有关,粒度在100目以上所制得的胶囊易漏油。此外,浸膏中含糖过多易受热软化堵住针头,因此,要根据药物的性质适当除糖。

    4   讨论

    在Caco-2细胞模型对莪术油及其单体的双向转运实验中,在不同浓度条件下,单体化合物及莪术油中相应成分A→B和B→A的表观渗透系数(Papp)均保持基本恒定,且莪术油中有效成分的吸收不受其他成分的干扰,因此可以表明莪术油中有效成分在Caco-2细胞模型中的转运机制均为被动扩散。莪术油中高脂溶性成分,包括呋喃二烯、莪术烯、β-榄香烯等成分在Caco-2细胞模型中并不透过,大部分被细胞摄取。莪术二酮和吉马酮在莪术油中含量较高,有较好地透过肠细胞的能力,且在磷酸缓冲液中比较稳定。

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作者单位:澳门大学中华医药研究院(△硕士研究生)

作者: 冷薇,郑颖,王一涛 2008-7-4
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