Literature
首页医源资料库在线期刊中华医药杂志2007年第7卷第3期

幽门螺杆菌毒素研究进展

来源:《中华医药杂志》
摘要:幽门螺杆菌(Hp)毒素是两种在致病性方面密切相关,而在免疫源性上又相互独立的蛋白质。一种是分子量约为87kD的空泡细胞毒素(VaculatingcytotoxinA,VacA),编码它的基因为vacA。另一种是分子量为128kD的细胞毒素相关蛋白(Cytotoxinassociatedprotein,CagA。表现出空泡毒素活性的Hp称为产毒菌Tox+菌。...

点击显示 收起

  幽门螺杆菌(Hp)毒素是两种在致病性方面密切相关,而在免疫源性上又相互独立的蛋白质。一种是分子量约为 87kD的空泡细胞毒素(Vaculating cytotoxin A,VacA),编码它的基因为vacA。另一种是分子量为128kD的细胞毒素相关蛋白(Cytotoxin associated protein,CagA。编码它的基因称为 cagA(cytotoxin associated gene A)。

    表现出空泡毒素活性的Hp称为产毒菌Tox+菌。所有的Hp都有vacA基因,但只有50%~60%的Hp为Tox+,表达vacA蛋白。只有60%的Hp具有CagA基因,表达CagA蛋白,所有这些菌称为CagA+菌。几乎所有的CagA+是Tox+,已有资料表明VacA和CagA与消化性溃疡及胃腺癌等严重胃黏膜疾病的发生有密切关系。

    1   VacA蛋白与vacA基因

    Hp毒素最早由Leunk等[1]在培养Hp的布氏培养基中发现的。用培养Hp的培养基浓缩液与Hela细胞一同培养,发现培养中的某些因子可以造成Hela细胞等真核细胞的空泡样变性,故称这种因子为空泡细胞毒素(Vaculating cytotoxin A,VacA)。进一步分析其性质,发现其对热敏感,70℃ 30min可使之失活,可被饱和硫酸胺沉淀,胰蛋白酶和蛋白酶K可使之失活,因而确定此物质为蛋白质。

    Hp培养上清液里的天然毒素是分子量大于600kD的寡聚体,由 6~7个具有空泡毒素活性的95kD VacA单体聚合而成[2],其中 70%是七聚体,30%是六聚体。深部冰冻蚀刻电子显微镜显示天然病毒的六或七个单体呈辐射状排列,结构对称而有规则,呈车轮状。95kD VacA单体随贮存时间的延长,在具有8个吸水性氨基酸的短重复序列区发生蛋白水解,分裂形成37kD N-末端和 57kD C-末端片段两部分[3]。天然毒素免疫兔后能产生高滴度的中和血清,而重组的VacA却不能产生中和反应[4],说明天然毒素有免疫原性,毒素的天然结构并不是毒素单体的非特异性聚集,而是具有有利于活性表达的特定构象。

    天然毒素的95kD单体的前体是vacA基因编码的一分子量为139.6kD的蛋白质分子,包括N-区一个含有33个氨基酸残基的前导信号序列,中间区87~95kD的细胞毒素及50kD的C-末端区。其中前导信号序列区域为一3kD的多肽,疏水;中间区为成熟的87kD的多肽,富含天冬酰胺,亲水[5]。1992年仍由Cover等[2]首先分离并纯化了Hp的空泡细胞毒素并测定了其性质。空泡细胞毒素是一个分子量为87kD的蛋白质单体,等电点为5.83。蛋白质氨基酸序列分析表明,空泡毒素与其他细菌分泌的毒素在氨基酸序列上无明显的同源性,而与一些跨膜离子转运蛋白的中间序列有部分的同源性。这些同源性可能与毒素的致病性有关。C-末端区是一48~50kD的多肽,氨基酸序列分析显示其与G-菌外胰蛋白有同源性。

    Schmitt[6]研究的结果认为,VacA蛋白在分泌过程中,139.6kD的前体蛋白质通过前导肽引导依据半依赖转运途径穿过细菌内膜,前导肽部分则在第33位丙氨酸和34位丙氨酸之间自动断裂而留于内膜内。通过外膜时,50kD的C-末端首先插入外膜中,然后易位,使87kD的VacA部分朝向外膜的外侧,在毒素和C-端50kD之间发生蛋白水解,有活性的87kD毒素分子被释放至细胞外,由此完成了空泡毒素的排泌过程。

    在Hp空泡细胞毒素纯化的基础上,有作者根据已知的蛋白质氨基酸序列推导编码空泡细胞毒素的 DNA序列,设计引物进行 HpDNA文库的筛选。Phadnis等[5]于1993年首先克隆得到了 Hp的空泡细胞毒素基因,即 VacA基因,并进行序列分析。vacA基因长 3888hp,已确定翻译的起始部位为AGGA,-35区和-10区的启动子部位。它所编码的蛋白质为一分子量136kD的前体蛋白,由1296个氨基酸组成。含有较丰富的天门冬酰胺,N-末端为一33个氨基酸残基组成的信号序列。纯化的VacA的N-端基因序列在这个信号序列之后,说明136kD的蛋白质可能是一个分泌性蛋白,而有活性的87kD蛋白则是它的裂解产物。vacA基因编码区中含有10个10~15bp的正向重复序列,其中8个重复序列在相同的阅读框中翻译,产生氨基酸重复序列,关于它们的功能还不清楚。进一步分析表明,Hp无论产霉菌还是非产毒菌,都含有单一拷贝的 vacA,在插入一段外源基因后,可使Hp失去空泡毒素活性,说明vacA基因与空泡细胞毒素活性有直接的关系。同年Telford等[7]也对Hp的vacA基因进行克隆测序,得到了大致相同的结果。

    所有 Hp中都具有 vacA,但井非所有的Hp都具有空泡毒素活性。有人认为有毒素活性Hp的vacA与无毒素活性Hp的vacA在DNA序列上有所不同,主要是vacA中间区的不同[8]。Atherton等[9]发现 4株 Tox+ Hp菌株 vacA基因中间区有高度的同源性,3株 Tox-菌株 vacA基因中间区亦有高度的同源性,而Tox-与Tox+ Hp菌株在此区则有显著的不同。将Tox+ Hp菌株的中间序列定为m1型等位基因,Tox- Hp菌株的中间序列定为m2型等位基因。Tox-与Tox+ Hp菌株vacA基因编码信号区序列前25个残基区具有高度一致性但其余的信号序列有明显不同。将Tox+株33个氨基酸的信号区序列定为s1,s1可再分为s1a和s1b,二者有12个碱基的差异。将Tox-株30个氨基酸的信号区序列定为s2。研究发现vacA基因有5种信号区与中间区的组合,其表达空泡毒素活性能力不同,由强到弱的顺序为s1a/m1>s1b/m1>s1a/m2>s1b/m2>s2/m2,未发现s2/m1的组合,这表明不同的vacA基因表达或分泌不同程度的VacA产物,一株Hp的vacA基因型可以体现体外空泡毒素活性的水平。s1a/m1型菌表现为较高的毒素活性,s2/m2型不具有毒素活性[18],但是Tox- Hp菌株vacA基因 亦编码一个142kD蛋白,与Tox+ Hp菌株VacA产物大小相似。此产物亦经过了C-端分裂和通过外膜的分泌过程,类似于 Tox+ Hp菌株的分泌机制。但其不表达空泡毒素活性,不清楚是否有其他功能。

    2   CagA蛋白与cagA基因

    1990年,Cover等[2]发现,具有空泡毒素活性的Hp培养液中全部可查到一种分子量为128kD的蛋白质,它虽不直接表达毒素活性,但与毒素表达密切相关;因此称为细胞毒素相关蛋白(Cytotoxin associated protein),因为编码它的基因称为cagA(Cytotoxin associated gene A),所以将这种蛋白称为 CagA。感染产毒 Hp菌株的病人 80%可在血清中查到抗 128kD抗体,而感染非产毒 Hp菌株的病人仅48%查到其抗体。十二指肠溃疡的病人中,几乎100%在血清中查到抗128kD抗体,而在感染Hp的无溃疡病人中仅有24%在血清中查到抗128kD抗体。CagA具有高度的亲水性和免疫原性,无前导肽及跨膜的疏水区域,以非分泌方式转运。大约60%~70%的Hp菌株含有cagA基因,表达CagA蛋白。不表达CagA蛋白的Hp 菌株是由于缺乏cagA基因,而不是复制或翻译水平缺陷。

    1993年,Tummuru等[10]和 Covacci等[11]分别克隆测序了cagA基因,发现与 vacA基因不同,CagA基因只存在于具有空泡细胞毒素活性的菌株中,在克隆得到长为 5925bp的 DNA片段中,开放的阅读框架位于535~3975之间,cagA基因编码的蛋白有1147个氨基酸残基,分子量为128012.73Da,等电点为9.72。DNA碱基分析,G+C含量为37%,与HpDNA G+C含量基本相同。在cagA基因也找到了核蛋白体的结合部位AGGAG,翻译起始密码ATG,在起始密码上游也有类似-35区或-10区的原核细胞DNA翻译的启动序列。

    3   VacA和CagA

    现在知道几乎所有的产毒菌是CagA+,而大部分非产毒菌是CagA-。Garner等[12]应用质粒pCTB4和cagA基因探针通过克隆杂交技术研究了32株Hp,分析了cagA基因和vacA基因之间的某些潜在联系,发现77.8%(14/18)与 cagA基因探针杂交的Hp菌株亦与 pCTB4杂交,同样的92.9%(13/14)不能与cagA基因探针杂交的Hp菌株亦不能与pCTB4杂交。cagA基因与vacA基因有显著相关性(P<0.001)。vacA基因中间序列的类型与 cagA基因有重要联系,但对亚群的分析表明,cagA基因与vacA基因信号序列类型的关系具有独立于其他因素的重要性。因此cagA基因的存在与sl型vacA信号区序列有很密切的关系。

    cagA基因虽与空泡毒素关系密切,但并不直接调节毒素活性。有推测cagA靠近vacA,可能是vacA的调控基因,CagA对VacA的合成、修饰、转运有一定作用。但有研究表明cagA与vacA在染色体基因组中的位置相距超过200kb,在cagA基因中插入外源基因导致cagA基因表达丧失,并不影响空泡毒素活性的表达。Hp毒素的cagA基因和空泡毒素的表达密切相关,但是这种相关性的基因基础还不清楚。

    通常产生毒素的Hp亦产生CagA蛋白,而不产生毒素的Hp拥有vacA基因却缺乏cagA基因。血清学研究已经指出CagA+菌株感染与发生十二指肠溃疡有关,抗CagA抗体的滴度与疾病的严重程度有关。但是有一些 Hp菌株并不同时拥有二者,说明 CagA蛋白对于 VacA的表达并不是必须的。可以发现一些Hp临床分离株只表达一种毒力因子,基于此种分析,大多数的临床分离株可归纳为两大类型[13];Ⅰ型菌含有cagA基因,表达CagA蛋白和VacA蛋白;Ⅱ型菌不含有cagA基因,不表达CagA蛋白和VacA蛋白。I型菌和Ⅱ型菌分别占56%和16%,而其余的28%为中间类型,即仅表达一种毒为因子。中间类型又分为4个亚型:a亚型组含有cagA基因,表达CagA蛋白,不表达VacA蛋白;b亚型组含有cagA基因,但不表达CagA蛋白,而表达VagA蛋白;c亚型组含有cagA基因,不表达CagA蛋白和VacA蛋白;d亚型组不含有cagA基因,不表达CagA蛋白,但表达VacA蛋白。

    4   cagA致病岛

    致病岛是致病细菌特有的,编码毒素蛋白参与致病的DNA片段,致病岛一般仅见于致病菌,占据较大的染色体区域,其 G+C含量与细菌不同。致病岛的侧面常存在一些特殊的 DNA序列,包括重复序列和插入序列元件。1996年 Censini等[14]发现 Ⅰ型 Hp菌株中含有约 40kb的段,具有致病岛的典型特征,并将其称为cag致病岛。cag致病岛可能以水平转移的方式来源于质粒和噬菌体,通过同源重组或位点特异性重组将完整的cag致病岛片段一次性插入染色体的谷氨酸消旋酶基因(glr3’)端[15]。其部分编码蛋白被证实为具有腺苷三磷酸(ATP)和核苷三磷酸(NTP)水解酶活性的跨膜转运蛋白复合体。

    cagA致病岛中有编码DNA螺旋酶的基因(NP0548),可参与尿素酶基因的表达[16]。cagA致病岛与Hp对胃上皮细胞表面Leb上抗原受体的结合表型有关,从而参与Hp的粘附机制。cagA致病岛还与VacA毒素的产生有关,并且参与细胞骨架重排、诱导宿主细胞核因子(NF)-κB表达、IL-8分泌[17]、细胞表面形状的改变、基垫结构的形成等。cagA致病岛还影响 Hp的溶血和凝血活性。cag致病岛及其编码蛋白相关功能的研究是目前Hp致病机制研究的热点,对cagA致病岛的深入了解有助于Hp致病机制的阐明,对Hp相关性疾病的防治有重要意义。

    5   展望

    CagA蛋白和VacA蛋白是Hp的主要致病因素,现已从蛋白水平,基因水平阐明了CagA蛋白和VacA蛋白及cag或vacA基因的结构。临床研究也已经证实CagA蛋白和VacA蛋白在溃疡等较严重胃十二指肠动膜病变中的重要地位。目前虽对其作用机制有所了解,但其具体作用机制,特别是CagA及cagA在VacA表达及黏膜损伤中所起的作用仍有待进一步研究。口服纯化的VacA可减轻Hp毒力株对小鼠胃轮膜的攻击,说明VacA有免疫原性,可能成为预防Hp感染的疫苗。但重组的VacA却没有生物活性,提示VacA在体内有构象变化。随着这方面研究深入,VacA构象问题的解决,VacA有可能成为预防Hp感染的有效组分疫苗。

【参考文献】
  1 Leunk RD, Johnson PT, David BC, et al. Cytotoxin activity in broth - culture filtrates of Campylobacter pylofi. J Med Microbial,1988, 26:93.

2 Cover TL, Blser MJ. Purification and characterization of the vacuotion toxin from Helieobecter pylori. J Biol Chem, 1992, 267:10570.

3 Telfoid JL, Ghiara P, Dell’ Oreo M, et al. Gene structure of the Helicobacter pylori cytotoxin and evidence of its key role in gastric disease. J Exp Med, 1994, 179:1653.

4 Lupetti P, Heuser JE, Manetti R, et al. Oligemeric and subunit structure of the Helicobacter pylori vacuolating cytctoxin. J Cell Biol, 1996, 133:801.

5 Phadnis SH, liver D, Janzon L, et al. Pathological significance and molecular characterization of the vacuolating toxin gene of Helicobacter pylori. Infect Immun, 1994, 62:1557.

6 Schmitt W, Haas R. Genetic analysis of the Helieobacter pylori vacuolating cytotoxin: stmctural similarities with the IgA protease type of exported protein. Mol Miembiol, 1994, 12 (2): 307.

7 Telford IL, Ghiara P, Deddoreo M, et al. Gene stxucture of the Helieobacter pylori eytotoxin and evidence of its key role in gastric disease. J Exp Med, 1994, 179:1635.

8 Cover IL, Tmnmum MK, Gao P, et al. Divergence of genetic sequences for the vacuolallng cytotoxin among Helieobacter pyloristrains. J Bid Chenm, 1994, 269:10566.

9 Athertan JC, Cao Ping, Peek RM, et al. Mosaicism in vacuolating cytotoxin alleles of Helicobacter pylori. J Bio Chem, 1996,270:17771.

10 Tummum MKR, Cover TL, Blaser MI. Cloning and expression of a high-molecular- mass major antigen of Helicobacter pylori: evidence of linkage to cytotoxin production. Infect Immune, 1993, 61:1799.

11 Covacci A, Censini S, Bugnoh M, et al. Molecular characterization of the 128-kDa immunodominant antigen of Helicobacter pylori associated with cytotoxicity and duodenal ulcer. Proc Nad Acad Sci USA, 1993, 90:5791.

12 Garner JA, Cover TL. Analysis of genetic diversity in cytotoxin - producing and non - cytotoxin - Producing Helicobacter pylori strains. J Infect Dis, 1995, 172:290.

13 Xiang Z, Censini S, Bayeli PF, et al. Analysis of expression of CagA and VacA virulence factors in 43 strains of Helicobacter pylori reveals that clinical isolates can be divided into two major types and that CagA is not necessary for expression of the vacuolating cytotoxin. Infect Immun, 1995, 63:94.

14 Censini S, Lange C, Xiang Z, et al. Cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes typeⅠ-specific and disease-associated virulence factors. Proc Natl Acad Sci Usa, 1996, 93:14648-14653.

15 Akopyants NS, Clifton SW, Kersulyte D, et al. Analyses of the cag pathogenicity island of helicobacter pylori. Mol Microbiol, 1998, 28:37-53.

16 McGee DJ, May CA, Garner R M, et al. Isolation of Helicobacter pylori genes that modulate urease activity. J Bacteriol, 1999,181:2477-2484.

17 Segal ED, Lange C, Covacci A, et al. Induction of host signal transduction pathways by Helieobacter pylori. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94:7595-7599.


作者单位:262500 山东青州,潍坊市益都中心医院

作者: 王玉芳,孟凡杰,童文珍 2008-7-4
医学百科App—中西医基础知识学习工具
  • 相关内容
  • 近期更新
  • 热文榜
  • 医学百科App—健康测试工具