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首页医源资料库在线期刊中华医药杂志2007年第7卷第3期

质粒DNA提纯方法的研究

来源:《中华医药杂志》
摘要:【摘要】目的探讨提纯质粒DNA的方法并进行检测。方法首先采用条件不相同的碱裂解法获含质粒DNA的上清,然后分别以传统的酚-氯仿抽提法(A)、异丙醇沉淀法(B)、QIAprepSpinMiniprep试剂盒(C)和QIAGENplasmidMidi试剂盒(D)提纯质粒DNA,经紫外分光光度计测A260和A280值并进行琼脂糖凝胶电泳和双酶切......

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【摘要】  目的 探讨提纯质粒DNA的方法并进行检测。方法 首先采用条件不相同的碱裂解法获含质粒DNA的上清,然后分别以传统的酚-氯仿抽提法(A)、异丙醇沉淀法(B)、QIAprep Spin Miniprep试剂盒(C)和QIAGEN plasmid Midi试剂盒(D)提纯质粒DNA,经紫外分光光度计测A260和A280值并进行琼脂糖凝胶电泳和双酶切反应,分析其效率和质量。结果 C、D法提纯的质粒DNA的含量、纯度和收获率均较A、B高,上述4种方法提纯的质粒DNA都能进行酶切反应。结论 碱裂解法提纯质粒DNA能满足基因工程实验的基本要求,且用柱层析提纯更好。

【关键词】  质粒DNA; 碱裂解法; 提纯方法; QIAGEN试剂盒

     Research on plasmid DNA extraction and purification methods

    HUANG Shi-he,ZHOU Cai-xue,PENG Xiang-bing,et al. Wuhan Institute of Biological Products,Wuhan 430060,China

    【Abstract】   Objective   To explore plasmid DNA extraction and purification methods as well as measure plasmid DNA. Methods   At first,supernatants containing plasmid DNA were obtained using different conditions of alkaline lysis method, then extracted and purified plasmid DNA by traditional phenol-chlorform(A),isopropanol precipitation(B),QIAprep spin miniprep kit(C) and QIAGEN plasmid Midi kit(D) respectively, measured A260 and A280  values of plasmid DNA using Beckman DU-70 spectrophotometer. DNA efficiency and quality can be analysed by agarose gel electrophoresis and double enzymatic digestions. Results   The content, purity and yield of plasmid DNA from C and D method were higher than A and B method .These plasmid DNA were digested with double restriction endonucleases.Conclusion   The alkaline lysis method for extraction of plasmid DNA can meet the basic needs of genetic engineering experiments, and plasmid DNA purified with QIAGEN anion exchange resin column was much better.

    【Key words】   plasmid DNA; alkaline lysis method; purification method; QIAGEN kit

    质粒DNA的提纯是基因工程实验中最常用的试验方法之一,质粒DNA提纯效率和质量与其后续实验步骤(如PCR扩增、酶切、连接、转化大肠杆菌和转染真核细胞等)的成功与否有着直接的关系,因此高效快速地从细菌细胞中提纯质粒DNA 具有重要的意义,本文用碱裂解法对小提和中提质粒DNA方法进行了研究。

    1   材料与方法

    1.1   材料

    1.1.1   供试菌株   大肠杆菌DH5α(携带pAC-HBS-Fc质粒),由本所构建,含650bp的Fd外源基因片段。

    1.1.2   试剂与溶液   溶液I:50mmol/L葡萄糖,10mmol/L EDTA,25mmol/L Tris-HCl,pH 8.0;溶剂Ⅱ:0.2mmol/L NaOH,1% SDS;溶剂Ⅲ:3mol/L NaAc,冰乙酸11.5ml, 水28.5ml。QIAprep Spin Miniprep试剂盒(内含QIAprep Spin柱、溶液P1、P2、N3、PE、EB和RNaseA溶液)和QIAGEN Plasmid Midi试剂盒(内含QIAGEN-tip100柱、溶液P1、P2、P3、QBT、QC、QF和RNaseA溶液)、限制性内切酶BcuI(Spe I)和XhoI及1kb DNA  Ladder均购自Fermentas公司。

    1.2   方法

    1.2.1   质粒DNA提纯方法   从琼脂平板上挑取含有外源基因质粒的大肠杆菌DH5α单菌落,接种到3ml的LB液体培养基的菌管内,37℃摇床培养8h,然后按1:100接种量接种于3支3ml LB液体培养基菌管和2个30ml LB培养基的锥形瓶里,37℃ 250rpm振荡过夜(约16h)。

    1.2.1.1   方法A   质粒碱裂解法:将上述1支菌管的培养物分2次收集于1.5ml的Eppendrof( EP)管中,每次室温10000rpm,离心30s,弃上清,空干后加入冰预冷的100μl溶液Ⅰ,强烈振荡使菌体分散均匀,继续加入200μl溶液Ⅱ,盖紧管口,快速颠倒EP管5次,以混合内容物,不要强烈振荡,冰浴3min,然后加入冰预冷的150ml溶液Ⅲ,盖紧管口,温和振荡10s,冰浴5min,于4℃ 10000rpm离心10min,取上清移至新的EP管中,加入等体积酚-氯仿抽提液(酚:氯仿为1:1),振荡混匀,于4℃ 12000rpm离心10min,取上清移至另一个新EP管中,加入等体积氯仿,振荡混匀,于4℃12000rpm离心10min,取上清移至另一新EP管中,加入1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2)和2.5倍体积无水乙醇混匀,置-20℃ 2h,于4℃12000rpm离心15min,弃上清,加入1ml 70%预冷乙醇洗涤沉淀,于4℃ 12000rpm离心15min,弃上清,在超净台内吹干,用20μl含RNaseA灭菌双蒸水溶解,-20℃保存[1] 。

    1.2.1.2   方法B   异丙醇沉淀法:基本步骤同方法A,不同之处在于:加溶液Ⅱ和Ⅲ不冰浴;所有离心都在室温条件下进行;加溶液Ⅲ离心后的上清加异丙醇而不加苯酚和氯仿,混匀离心,取上清移至另一个新的EP管中,后面的步骤同方法A。

    1.2.1.3   方法C    QIAprep Spin Miniprep Kit提取方法:依次加入试剂盒内的溶液P1、P2、N3,室温13000rpm 离心10min,吸上清至QIAprep Spin柱内,离心30s,用0.75ml溶液PE洗QIAprep柱,弃穿流液,再离心30s,去掉残留的乙醇,将QIAprep柱至另一个干净1.5ml EP管,加20μl无菌双蒸水,静置1min,室温13000rpm离心1min,含质粒DNA的液体置-20℃保存。

    1.2.1.4   方法D   QIAGEN Plasmid Midi Kit提纯方法:将2个锥形瓶里的细菌培养液30ml分别置于2个50ml离心管里,4℃ 4000rpm离心30min,吸上清于另2个干净的50ml离心管里,依次加入试剂盒的溶液P1、P2和预冷的溶液P3,冰浴15min,4℃ 10000rpm离心10min,立即吸取上清于另2个干净50ml离心管里,4℃ 10000rpm离心5min,再吸上清于另2个干净50ml离心管里,将上清吸入到用4ml溶液QBT平衡QIAGEN-tip100柱内,流干后,用溶液QC洗涤柱,洗2次,10ml/次,将QIAGEN-tip100柱放置另2个50ml离心管里,用溶液QF洗脱DNA,加3.5ml(0.7体积)的室温异丙醇到洗脱液里,立即混匀,吸入6支1.5ml EP管里,13000rpm离心15min,弃上清,在超净台内吹干,每支DNA沉淀物用10μl无蒸双蒸水溶解,合并后置-20℃保存。

    1.2.2   质粒DNA定量和纯度分析   利用BECKMAN公司的Du○R-70分光光度计,以无菌双蒸水为对照,测定质粒DNA样品的吸光值A260nm和A280nm,计算DNA浓度,其计算公式为:DNA浓度(DNAμg/ml)=OD260×[(50μgDNA/ml)/1OD260];DNA产量(DNAμg)=DNA浓度(DNAμg/ml)×(总体积ml)。根据A260和A280的比值来估计制备样品的DNA纯度,6个月后重新测定A260nm和A280nm及计算A260/A280,一般认为A260/A280=1.8~2,其DNA纯度较高。

    1.2.3   琼脂糖凝胶电泳   取5μl小提质粒DNA溶液和1μl中提质粒DNA溶液,在0.8%琼脂糖凝胶上以5V/cm的电压电泳1h,ED染色20min,在Pharmacia Biotech 公司的Image Master TM VDS 生物影像分析系统上紫外照像,根据条带亮度进一步判定DNA浓度,同时判别蛋白质和RNA等杂质是否除尽。

    1.2.4   质粒DNA双酶切电泳分析   用上述4种方法提纯的质粒DNA经SpeI和XhoI双酶切反应分析,其反应体系为20μl 10×Buffer TangoTM with BSA 2μl、DNA 1μg、SpeI 和XhoI各1μl加无菌双蒸水至体积为20μl。混匀后置于37℃温浴4h,然后取10μl酶切产物电泳,EB染色,紫外照像。

    2   结果

    2.1   质粒DNA的浓度、产量和纯度   见表1。

    2.2   质粒DNA的稳定性   上述A、D两种方法提纯质粒DNA样品,经-20℃保存6个月后重新测定A260和A280(见表2)。表1   不同方法提纯质粒DNA的结果从表1中可看出用C、D方法提纯质粒浓度、纯度和收获率均高于A、B方法。表2   质粒DNA的稳定性从表2可看出质粒DNA的浓度和纯度较大幅度地下降。

    2.3   琼脂糖凝胶电泳分析   4种不同方法提纯质粒DNA样品,电泳检测结果都出现3条区带,且这3条区带在位置上基本对称。但A和B出现了较多的降解RNA,C和D提纯的DNA超螺旋结构完整,RNA蛋白质及盐类污染物质少。D的区带亮度最强。

    2.4   限制性内切酶双酶切后琼脂糖凝胶电泳分析   这4种方法提纯质粒DNA样品经酶切后的电泳分析,都能观察到650bp的目的片段Fd和约5000bp的载体片段,但C和D方法观察到的区带更清楚。

    3   讨论

    质粒DNA的产量和质量取决于很多因素,如质粒拷贝数、宿主菌株、接种量、抗生素、培养基的类型和提纯方法等,本研究用在同一培养液中的含相同菌株的细菌培养物研究了其纯化方法,不管是小提还是中提质粒DNA实际上都采用了碱裂解法,其原理是:溶液Ⅰ或溶液P1主要是使细胞悬浮,并且EDTA可与Ca2+和Mg2+鳖合抑制DNase的活性,加入后应充分混匀,使细菌沉淀完全分散;溶液Ⅱ或溶液P2含NaOH和SDS,SDS使细胞膜上的磷脂和蛋白质成分溶解,引起细胞成分的裂解和释放,同时NaOH能使染色体、蛋白质和质粒DNA变性,最佳裂解时间应使质粒DNA从细胞里最大程度地释放染色体DNA,使释放质粒DNA尽可能在短时间内接触变性条件,长时间接触碱性条件能引起质粒成为不可逆性变性,所以加入溶液Ⅱ或P2后混匀动作要轻柔,反应时间控制在5mm内;溶液Ⅲ或P3或N3含酸性KAc,这种高盐浓度能引起十二烷基硫酸钾(KDS)与变性的蛋白质、染色体DNA、细胞碎片和SDS沉淀,质粒DNA仍留在溶液里,重要的是加这步溶液要完全轻柔混匀确保变性成分完全沉淀,因此离心时间较长(≥10min),实验结果表明A、B两种方法提纯质粒DNA的浓度和收获率较C、D两种方法低,这与纯化质粒DNA的方法密切相关,在用QIAGEN的柱子纯化开始时,P1溶液里加入了RNaseA,在碱性裂解期间,消化并使RNA有效地释放,产生的RNA片段在盐和pH条件下不能与QIAGEN柱里的树脂结合留在穿流液里,所以C、D两种方法提纯的质粒DNA几乎不含RNA和蛋白质等杂质(见表1),其浓度和纯度较高。且方法D的浓度和收获率较方法C高,因为在转染真核细胞时需要较高浓度(0.5μg/μl)质粒DNA只有用方法D,因为方法C在最后洗脱柱上的DNA时,若加无菌蒸馏水量少,无法完全洗脱,但过多加入无菌蒸馏水,浓度则很低,对后续实验有影响。方法A和方法B提纯的质粒DNA在浓度、纯度、产量和收率方面基本一致,但方法B有如下优点:(1)离心在室温下进行,不必采用低温离心机;(2)避免用苯酚和氯仿等刺激性物质;(3)不放冰浴,缩短实验时间[2,3]。

    实验还发现,半年后测定方法A和D提纯质粒的DNA的 A260和A280,计算它们的浓度和纯度都下降较大,发现用无菌双氧水较长时间(6个月)保留质粒DNA稳定性差,因此,很多研究者用TE溶液在-20℃保存质粒DNA。

    总之,这4种质粒提纯方法各有利弊,方法A和B所用试剂便宜,节约成本,但浓度、纯度和收获率相对较低,方法C和D成本较高,但浓度、纯度和收获率较高,且方法C提纯质粒DNA所需时间短(1h),1次可提纯多个样品质粒DNA,方法D的质粒DNA浓度更高,可用于真核细胞(sf 9细胞)转染实验[4]。

【参考文献】
  1 巴克.分子生物学实验室工作手册. 北京:科学出版社,2005,206.

2 倪志华,赵晓瑜,刘建华,等. 碱裂解提取质粒DNA的改进方法. 河北大学学报(自然科学版),2005,25(2):222.

3 姚伟,周会,徐景新,等. 质粒DNA小量提取法的改进. 应用与环境生物学报,2005,11(6):776.

4 黄仕和,彭祥兵,张爱华,等.抗乙型肝炎病毒表面抗原的IgG全抗体表达载体的构建. 中国生物制品学杂志,2007,20(3):107.


作者单位:1 430060 湖北武汉,武汉生物制品研究所 2 100052 北京,中国疾病预防控制中心病毒病控制所

作者: 黄仕和,周才学,彭祥兵,周志军,王萍,张爱华,闭兰 2008-7-4
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