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【摘要】 目的 对连翘提取物连翘酯苷注射剂进行免疫学方面的实验研究。方法 体内与体外相结合的方法进行免疫学实验。结果 连翘酯苷能促进SRBC抗体的产生，与N，S、Cy对照组差异有非常显著性(P<0.01)；能增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力，与NS、Cy对照组差异有非常显著性(P<0.05)；不同的剂量注射给动物，能促进小鼠胸腺、脾脏免疫器官细胞的增殖，与NS对照组差异有极显著性(P<0.01)，体外对免疫细胞的增殖作用与对照组相比差异无显著性。结论 连翘酯苷注射剂注射给小鼠后能有效地提高小鼠的特异性和非特异性免疫力。
【关键词】 连翘酯苷；免疫学；实验
Immunological tests of forsythoside
WANG Hong-jun，JIANG Hong，ZHOU Tie-zhong.Animal Medical Academy of Liaoning Medical College，Jinzhou 121001,China
【Abstract】 Objective Study of immunological tests on forsythoside injection which had been distilled from Fructus forsythiae.Methods It took on combining test methods of in vivo and in vitro each other.Results Results of the specific immunity tests showed that forsythoside injection could expedite produce of antibody of sheep red blood cell (SRBC). There was the most sigfnificant difference to compare with both naturalbrins（NS）and Cyclophosphamide monohydrate（Cy） (P<0.01). Results of the non-specific immunity tests showed that forsythoside injection of the different dose had the better action to the viscera index of immunity organ. There was the most significant difference to compare with NS (P<0.01). And it could increase the ability of macrophage engulfing chicken red blood cells. There was significant difference to compare with NS and Cy(P<0.05).It was not significant in PHA-P stimulative test that it enhanced the multiplication of immune cells in vitro.Conclusion The Forsythoside injection could enhance specific immunity and nonspecific immunity of the rat.
【Key words】 forsythoside；immunology；test
连翘属植物中的咖啡酰糖苷类成分连翘酯苷（Forsythoside）对多种革兰阳性菌、革兰阴性菌有抑制作用，如：金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌、副伤寒杆菌、溶血性链球菌、大肠埃希菌、变形杆菌等［1，2］。另外，连翘酯苷还具有抗病毒［3］、抗炎镇痛［4］、抗内毒素［5］、抑制弹性蛋白酶活性［6］等药理作用。本文就连翘提取物连翘酯苷在免疫学方面的作用进行实验研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药物 连翘购自北京同仁堂药店，连翘酯苷自制；左旋咪唑，Sigma公司；注射用环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司(批号：03110121)。
1.1.2 试剂 MTT、PHA，Sigma公司；DMSO(A.R)，天津市科密欧化学时间开发中心；RPMI-1640培养基，GIBCO公司；胎牛血清，杭州四季青生物工程材料技术有限公司(批号：030620)；苯甲醇(A.R)，天津市化学试剂六厂分厂(批号：20000325)；吐温-80(A.R)，上海申宇医药化工有限公司(批号：020624)；Giemsa，北京化学试剂公司(批号：931106)；台盼兰，Acros公司(批号：A014443301) ；RPMI-1640，GIBCO公司；PBS（pH 7.2～7.4）、无钙镁的 Hank’s液、Alserver’s液、10%CRBC悬液、10%SRBC悬液均自行配制。
1.1.3 仪器 Acculab电子天平（0.0001g），北京赛多利斯仪器系统有限公司； JJT-1300超净工作台，北京半导体设备一厂；自动立式压力灭菌器，上海申安医疗器械厂。550型酶标仪，BIO-RAD公司；二氧化碳培养箱，日本SANYO公司；倒置显微镜，日本OLYMPUS公司；普通显微镜，NIKON公司；磁力搅拌器，北京北德科学器材有限公司。
1.1.4 实验动物 ICR小白鼠购自北京实验动物中心；海兰褐公鸡(35日龄)，北京农学院寄生虫教研室；小尾寒羊，北京盛世富民清真食品有限公司。
1.2 方法
1.2.1 药液的配制 左旋咪唑(Le)用生理盐水配制成5.0mg/ml，环磷酰胺(Cy) 用生理盐水配制成10.0mg/ml，连翘酯苷(F)以苯甲醇和吐温-80为助溶剂，注射用水配制成10mg/ml、2.5mg/ml、0.625mg/ml，过滤除菌后备用。
1.2.2 血凝集素实验 具体操作方法见文献［7］。
1.2.3 巨噬细胞(MΦ)吞噬鸡红细胞实验 具体操作方法见文献［7］。
1.2.4 PHA-P刺激淋巴细胞增殖实验 具体操作方法见文献［7］。
1.2.5 免疫器官指数实验方法 实验小鼠分成4组，每组6只，3个药物组连翘酯苷的浓度分别为0.00625g/kg、0.025g/kg、0.1g/kg，一个空白对照组即N.S组，连续给药4天后，称取各组小鼠的体重，处死后，分别分离给药组和对照组小鼠胸腺、脾脏并称取各自的重量，计算脏器指数，给药组脏器指数与对照组小鼠的进行比较，以说明给药组对动物免疫器官的影响。
1.3 统计学方法 应用DPS数据处理软件中Duncan新复极差法、Microsoft Excel统计学软件、χ2检验对数据进行统计学分析。
2 结果
2.1 血凝集素实验结果 连翘酯苷（F）与对照组绵羊红细胞(SRBC)的抗体积数结果见表1。F的抗体积数为124.5，与NS、Cy组差异有非常显著性(P<0.01)，能显著地提高小鼠体内SRBC抗体的效价。表1 各组抗体积数 注：表中不同字母表示各组间差异有非常显著性（P<0.01）
2.2 巨噬细胞(MΦ)吞噬鸡红细胞实验结果 连翘酯苷和对照组小鼠腹腔MΦ吞噬力测定结果见表2、表3，连翘酯苷组小鼠腹腔MΦ的吞噬率59.8%，显著高于Le组(P<0.05)，非常显著高于NS、Cy组(P<0.01)；吞噬指数为1.106，显著高于NS、Cy组(P<0.05)。表2 各组巨噬细胞的吞噬率注：表中不同字母表示各组间差异有显著性，a与b、b与c之间差异有显著性(P<0.05)，a与c之间差异有非常显著性(P<0.01) 表3 各组巨噬细胞的吞噬指数注：表中不同字母表示各组间差异有非常显著性（P<0.05）
2.3 PHA-P刺激淋巴细胞增殖实验结果 以生理盐水为对照组，各组的SI值见表4，连翘酯苷组SI值为1.098；以环磷酰胺为对照组，各组的SI值见表5， 连翘酯苷组SI值为1.288，与对照组间差异无显著性。表4 各组与生理盐水空白对照组比较的SI值表5 各组与环磷酰胺阴性对照组比较的SI值
2.4 免疫器官指数实验结果 不同浓度的连翘酯苷对小鼠脾脏的影响见表6，给药组由高到低的脾脏指数分别为9.267、6.45、5.533 (mg/g)。不同浓度的连翘酯苷对小鼠胸腺的影响见表7，给药组由高到低的胸腺指数分别是3.6、2.767、2.367 (mg/g)。实验数据亦表示，随着药物浓度的增加，其免疫器官的脏器指数亦呈上升趋势。表6 各组脾脏指数注：表中不同字母表示各组间差异有非常显著性（P<0.01）注：表中不同字母表示各组间差异有非常显著性（P<0.01）
3 讨论
连翘酯苷是迄今为止从连翘属植物中发现的抗菌活性最强的成分之一，还具有抗病毒作用，而且是连翘的主要特征性成分，因此在评价连翘及以抗菌为主要功效的制剂质量时以该化合物为评价指标较为合适，而以连翘苷为指标是不合适的［8］。故本项研究以连翘酯苷作为研究对象，并对其进行了影响小鼠免疫力的实验。
绵羊红细胞(SRBC)抗体的测定实验表明，连翘酯苷组抗体效价明显高于生理盐水空白组和环磷酰胺组，呈现差异非常显著性（P<0.01）。这表明连翘酯苷能显著的提高小鼠的特异性免疫，有助于增强小鼠的机体抵抗力。
巨噬细胞吞噬率的测定实验表明，连翘酯苷组巨噬细胞的吞噬率显著高于阳性对照组左旋咪唑组(Le)(P<0.05)，非常显著高于空白对照组NS组、阴性对照组Cy组 (P<0.01)。巨噬细胞吞噬指数的测定表明，连翘酯苷组吞噬指数显著高于NS、Cy组，说明连翘酯苷能增强小鼠巨噬细胞吞噬红细胞的能力。由此表明连翘酯苷腹腔注射能显著的提高小鼠腹腔巨噬细胞的非特异性免疫力。
本项研究中淋巴细胞增殖实验结果表明，连翘酯苷对体外培养的淋巴细胞增殖作用与对照组相比不显著，但通过对小鼠免疫器官影响的实验表明，不同剂量的连翘酯苷给小鼠注射后，胸腺和脾的脏器指数随剂量的增加而增大，而且与NS差异有非常显著性(P<0.01)。
通过一系列实验研究和文献报道，连翘酯苷不仅具有较好的抗菌活性，而且还具有提高小鼠巨噬细胞的吞噬力、促进抗体的产生、促进免疫器官细胞生长等增强机体特异性和非特异性免疫力的作用，并且这些作用尚未见到文献报道。另外，通过对连翘酯苷免疫学方面的实验研究，将有助于该物质的进一步研发，若将此化学物制成药剂用于病毒性疾病的防治，可能具有一定的应用前景。
【参考文献】
1 王宏军，蒋红，吴国娟. 连翘酯苷在体内与体外的抑菌效果研究. 中国饲料，2005（10）：26 -27.
２ 李晓燕. 中药连翘抗菌活性的考察.山东医药工业, 1997,16(2)： 46.
3 胡克杰,徐凯建,王跃红,等. 连翘酯甙体外抗病毒作用的实验研究.中国中医药科技 , 2001,8(02)：89.
4 芮菁,尾崎幸,唐元泰.连翘提取物的抗炎镇痛作用.中草药, 1999,30(1)：43.
5 高淑娟,戴锡珍,要华民.几种清热解毒中药抗内毒素作用的比较实验.天津中医,1992,(3)：42.
6 张立伟,赵春贵,王进东,等. 连翘酯甙分离提取及抑制弹性蛋白酶活性研究. 化学研究与应用， 2002,14(2):219-221.
7 王宏军，吴国娟，孙健，等. 绿原酸的药效学研究. 中兽医学杂志，2005（5）：7-11.
8 方翠芬, 靖会, 李教社,等. HPLC法测定市售连翘中连翘酯苷的含量. 中国药事, 2003,17(12)：760-761.
作者单位：121001 辽宁锦州，辽宁医学院动物医学院