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【摘要】 目的 探讨食管癌组织中基质金属蛋白酶－2（MMP-2）和CD44v6蛋白的表达及其临床意义。 方法 应用免疫组化S-P法检测50例食管癌组织中MMP-2和CD44v6蛋白的表达，并分析其与食管癌临床病理特征的关系。结果 50例食管癌中MMP-2和CD44v6蛋白表达明显高于其在正常食管上皮组织中的表达。MMP-2和CD44v6高表达与食管癌纤维膜浸润、淋巴结转移均密切相关（P＝0.011， P＝0.034和P＝0.022， P＝0.001）。食管癌组织中MMP-2表达与CD44v6表达呈正相关（r＝0.427，P＝0.002）。结论 MMP-2和CD44v6表达是食管癌发生与发展的重要促进因子，其过度表达与食管癌浸润转移密切相关。检测MMP-2和CD44v6蛋白表达可作为判断食管癌预后的客观指标。
【关键词】 食管癌；侵袭转移；MMP-2；CD44v6；免疫组织化学
Expression of MMP-2 and CD44v6 in esophageal carcinoma and its clinical significance
GAO Xiu-hua,LI Jie-ru,HAN Ju-qiang.Bethune International Peace Hospital， Shijiazhuang 050082，China
【Abstract】 Objective To investigate the clinical significance of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and CD44v6 in esophageal squamous cancer (SSC).Methods The MMP-2 and CD44v6 expression were studied by immunohistochemical staining，and the relationship between MMP-2 and CD44v6 expression and pathlogical features in 50 specimens of esophageal cancer were analyzed.Results The expression of MMP-2 and CD44v6 in 50 specimens of esophageal cancer were higher than that of MMP-2 and CD44v6 in normal esophageal tissues. The high expression of MMP-2 and CD44v6 were positively correlated with lymph node metastasis and fibromembranous infiltration （P＝0.011， P＝0.034和P＝0.022， P＝0.001）.The expression of MMP-2 was positive relation to that of CD44v6 （r＝0.427，P＝0.002）.Conclusion The detection of expression about MMP-2 and CD44v6 in esophageal carcinoma may be helpful to judge the malignant behavior，metastasis and progronsis. MMP-2 and CD44v6 may be prognostic indicators in esophageal carcinoma.
【Key words】 esophageal carcinoma； invasion； metastasis；matrix metalloproteinase-2； CD44v6； immunohistochemisty
食管癌是我国常见的消化道恶性肿瘤之一，其主要死亡原因是术后转移。大量研究表明，食管癌的形成和转移是一个多基因、多因子共同作用的结果。本研究通过对食管癌组织中MMP-2和CD44v6蛋白表达的检测，探讨MMP-2和CD44v6表达与食管癌侵袭转移的关系及MMP-2和CD44v6蛋白表达之间的相关性，为预测食管癌浸润转移提供客观参考指标。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选自河北医科大学第四医院2001年7月～2002年12月食管癌患者手术切除标本共50例，其中男30例，女20例；年龄43～75岁，平均60岁；其中高分化鳞癌22例，中分化鳞癌13例，低分化鳞癌15例；有周围淋巴结转移者30例，无转移者20例。同时留取癌旁1～2cm处不典型增生组织17例，取切缘正常黏膜组织12例作对照。患者术前均未进行任何抗癌治疗，所有标本经10％福尔马林液固定，石蜡包埋，4μm连续切片备用。
1.2 免疫组织化学方法 采用S-P方法，DAB染色，S-P免疫组化试剂盒购自北京中山生物技术有限公司，一抗为鼠抗人MMP-2单克隆抗体和鼠抗人CD44v6单克隆抗体，工作液浓度分别为1:40，1:50。均为浓缩型产品。用已知的乳腺癌标本作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。
1.3 免疫组化结果判断 MMP-2和CD44v6在细胞浆和细胞膜出现棕黄色颗粒为阳性细胞，癌细胞、间质成纤维细胞、内皮细胞等均有MMP-2表达，但表达程度不一，高表达主要见于癌细胞，阳性计数仅限于肿瘤细胞染色，间质染色则除外。采用HPIAS-1000病理图文分析系统，将切片上的阳性染色信号转化为灰度进行分析。选择每张免疫组化切片，用组织切片空白处入射光的值作为定标。每张切片测定6个高倍视野（10×40）中的每个阳性细胞的胞浆或膜的灰度，取平均值作为测定值，最后以净灰度值为一张切片的终值，同时作为统计值。净灰度值=间质空白处灰度值-癌巢（或上皮）阳性细胞的灰度值。
1.4 统计学分析 数据用x±s表示，各组间比较采用F检验、t检验，相关性采用Spearman相关分析，当P<0.05时表明差异有显著性。所有统计均由SPSS12.0统计软件包完成。
2 结果
2.1 食管癌中MMP-2和CD44v6蛋白表达 50例食管癌组织中MMP-2和CD44v6蛋白表达分别为净灰度值=64.151±24.670和净灰度值=53.360±17.614。MMP-2和CD44v6在癌组织中的表达明显高于癌旁组织和切缘正常组织（P＝0.000，P＝0.000），见表1。 表1 MMP-2和CD44v6在食管上皮各种病变中的表达
2.2 MMP-2和CD44v6蛋白表达与食管癌临床病理参数的关系 MMP-2和CD44v6的表达量与食管癌患者的性别、年龄及癌组织分化程度均无关（P为0.620，0.599，0.076和P为0.224， 0.083，0.132），而与癌组织浸润深度、淋巴结转移等密切相关（P为0.011，0.034和P为0.022，0.001）（见表2）。表2 MMP-2和CD44v6在食管癌中的表达
2.3 MMP-2与CD44v6的相关分析 在食管癌组织中MMP-2的表达与CD44v6的表达呈正相关（r＝0.427，P＝0.002）。
3 讨论
在肿瘤的发生和进展过程中，由于某些基因的异常表达及一系列的基因突变，使得一些肿瘤获得浸润及转移的特性，脱离原发瘤，穿透基底膜进入结缔组织，并侵袭淋巴管和血管等组织而发生转移。显然，肿瘤转移需要通过细胞与细胞间质或与其他细胞的一系列相互作用而完成。
基质金属蛋白酶（MMP）家族是一组锌离子依赖性内肽酶，几乎能降解细胞外基质（ECM）的所有成分。在病理情况下，MMP一方面通过降解基底膜和包绕肿瘤的基质，突破基质屏障，促进肿瘤侵袭转移，另一方面则通过毛细血管增生，新生血管生成等促进肿瘤生长和扩散。MMP-2是降解ECM和基底膜主要结构的关键酶，对某些恶性肿瘤的发展及间质血管生成起着重要的作用［1，2］。研究表明，MMP-2与多种恶性肿瘤的发展、侵袭、转移密切相关［3，6］。免疫组化和原位杂交研究证实，肿瘤细胞与间质细胞中均可表达MMP，但以肿瘤组织表达相对较高。本研究在应用免疫组化法检测50例食管癌、17例癌旁不典型增生组织和12例切缘正常组织中MMP-2的表达，结果显示，食管癌组织具有较强分泌MMP-2的能力，食管癌组织中MMP-2的表达明显高于癌旁组织和正常组织。与Samantaray［7］的研究结果相同，因而提示MMP-2参与食管癌的发生，作为食管癌发生的早期事件。本研究还发现，伴有淋巴结转移的癌组织中MMP-2蛋白表达量明显高于不伴有淋巴结转移的癌组织，同时有纤维膜浸润的癌组织中MMP-2蛋白表达量高于未浸润纤维膜的癌组织，提示肿瘤细胞向深层侵袭和以后的转移与其分泌的MMP-2有关，MMP-2是肿瘤侵袭和转移的一种促进因素。
CD44是一个近年来很受关注而分布极为广泛的细胞表面粘附分子，CD44蛋白属粘附分子家族中的一员，人类的CD44基因定位于11号染色体的短臂上，有20个高度保守的外显子组成。CD44根据基因外显子表达方式的不同，编码两种不同类型的蛋白，即标准型CD44s和变异型CD44v。
CD44v6是CD44v的一种拼接变异体，其表达可改变肿瘤细胞表面粘附分子的构成和功能，有助于肿瘤细胞获得转移潜能。CD44v6的促进转移作用机制可能是表达CD44v6的肿瘤细胞与淋巴管或血管内某一配体结合，使转移至那里的肿瘤细胞更加稳定的寄宿与生长，形成转移瘤。Nozoe等［8］研究发现CD44v6的高表达与食管鳞癌的侵袭和淋巴结转移有密切的关系， CD44v6在食管癌组织中的高表达，可作为判断食管癌恶性侵袭行为的指标。从本组实验研究资料可以看出，CD44v6表达与食管癌的分化程度无关，而与浸润深度有关；并且发现CD44v6基因蛋白在淋巴结转移组的表达，明显高于无淋巴结转移组。本研究提示细胞粘附分子CD44v6和食管癌的侵袭、转移能力有关，临床上检测CD44v6蛋白表达可作为预测食管癌转移及估计预后的客观指标。术前通过对食管癌进行活检，测定CD44v6的表达情况，有可能早期预测淋巴结转移，对阳性表达者，术中应更加彻底的进行淋巴结清扫，同时术后应严格进行化疗，以防食管癌的转移及复发。
在恶性肿瘤发生机制的癌基因研究中，许多学者提出了基因协同作用假说，认为在恶性肿瘤发生发展和转移的各阶段，至少有两个或两个以上功能不同的异常激活的基因各自发挥不同的作用，并在时间和空间上相互配合，协同细胞的癌变。本研究发现，MMP-2在食管癌组织中表达量明显高于癌旁不典型增生组织，同时CD44v6在食管癌组织中表达量也明显高于癌旁不典型增生组织；CD44v6表达量与MMP-2量表达与食管癌的纤维膜浸润、淋巴结转移呈显著正相关。表明CD44v6与MMP-2在食管癌的系列病理过程（如癌的发生、侵袭及淋巴结转移）中，具有正调节的协同作用的可能。深入探讨它们之间的作用机制，将对阐明和阻断肿瘤转移的形成具有重要价值。
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7 Samantaray S， Sharma R， Chattopadhyaya TK， et al. Increased expression of MMP-2 and MMP-9 in esophageal squamouscell carcinoma.J Cancer Res Clin Oncol, 2004，130(1):37-44.
8 Nozoe T， Kohnoe S， Ezaki T， et al. Significance of immunohistochemical over-expression of CD44v6 as an indicator of malignant potential in esophageal squamous cell carcinoma. J Cancer Res Clin Oncol,2004，130(6):334-338.
作者单位：1 050082 河北石家庄，白求恩国际和平医院2 050061 河北石家庄，石家庄卫生学校病理教研室