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【摘要】 目的 研究大建中汤对脾阳虚大鼠血中致痛物质P物质(SP)、 肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响。方法 将大鼠随机分为6组,每组10只:正常对照组、模型对照组、大建中汤大剂量组、大建中汤中剂量组、大建中汤小剂量组、消炎痛组。用饮食失调、劳倦过度加苦寒泻下的方法,建立脾阳虚大鼠模型后分别给予相应汤剂灌服治疗。取血处理后用放射免疫法测定各组大鼠血中致痛物质SP、TNF-α含量的变化。结果与结论 脾阳虚大鼠血中致痛物质SP、TNF-α的含量升高,大建中汤治疗组大鼠血中SP、TNF-α的含量均明显降低,这可能是其治疗脾阳虚腹痛的作用机制之一。
【关键词】 大建中汤; P物质; 肿瘤坏死因子α; 脾阳虚
大建中汤出自《金匮要略方论·腹满寒疝宿食病脉证治》第十四条:“心胸中大寒痛,呕不能饮食,腹中寒,上冲皮起,出见有头足,上下痛而不可触近,大建中汤主之”。全方由川椒、干姜、人参和饴糖组成,主治中阳衰微,阴寒内盛的腹痛证。 临床表现为疼痛剧烈,痛位广泛,其痛上下走窜而无定处,或腹部时见块状物,呕吐剧烈,手足逆冷。临床上常用于治疗多种以脾阳虚疼痛为主证的疾病,临证均收到满意效果。本课题研究大建中汤对脾阳虚大鼠血中致痛物质P物质(SP)、 肿瘤坏死因子α(TNF-α)的影响,从微观和分子水平上探讨大建中汤治疗脾阳虚导致腹痛的镇痛机制。
1 材料与动物分组
1.1 材料
1.1.1 实验动物 选用200~250g的实验用标准Wistar雄性大鼠(由贵阳医学院实验动物中心提供)。
1.1.2 实验主要材料及仪器 哺乳动物手术器械(手术剪、镊子、止血钳、试管、量杯、量筒、12号圆头灌胃针、5ml注射器)、滴定管、恒温水箱、电子天平(湖南仪器仪表总厂天平厂)、KDC-2044高速低温冷冻离心仪(中国科学技术大学实业总公司中佳光电仪器分公司)、Indesit低温冰箱(意大利产)、 GC-1200 γ放射免疫计数器(科大创新股份有限公司中佳分公司)。
1.1.3 实验药物及试剂
1.1.3.1 造模用药-番泻叶水浸液 将番泻叶按1:1比例与水混合,于恒温水浴箱中70℃浸泡24h,将浸得液在4℃冰箱中保存备用。
1.1.3.2 治疗用药 大建中汤大剂量,按人和动物折算公式[1]制备成1.5g生药/ml的水煎液;中剂量制备成0.75g生药/ml的水煎液;小剂量制备成0.375g生药/ml的水煎液。制备方法参照文献[2]。消炎痛(由山西临汾云鹏药业有限公司生产): 按人和动物折算公式[1]把消炎痛溶于生理盐水制备而成,其含消炎痛1.9mg/ml。
1.1.3.3 检测试剂 P物质放射免疫试剂盒、TNF-α放射免疫试剂盒,均由解放军总医院北京东亚免疫技术研究所提供。
1.2 实验动物分组 健康Wistar雄性大鼠60只,随机分为6组每组10只:正常对照组、模型对照组、大建中汤大剂量组、大建中汤中剂量组、大建中汤小剂量组、消炎痛组。
2 实验方法
2.1 造模方法的选择 根据《中医实验动物学》制定诊断标准为:(1)进食减少,体温下降,消瘦;(2)倦怠,嗜卧;(3)畏寒,肛温下降、扎堆;(4)大便溏薄,肛周污浊;(5)皮毛枯槁不荣杂乱。
2.2 造模方法 参照文献报道[3,4]的综合造模方法进行造模。
2.3 给药方法 从实验第22天开始,正常组、模型组均给予生理盐水10ml/(kg·d);大建中汤大剂量组、大建中汤中剂量组、大建中汤小剂量组分别给予10ml/(kg·d)的大建中汤水煎剂;消炎痛组灌服5ml/(kg·d)的消炎痛水溶液。连续给药7天。
2.4 标本的采集和保存 严格按规定程序进行,快速取血。测定SP取静脉血3ml,注入含0.5M EDTA-Na2 30μl和抑肽酶1500KIU试管中混匀,离心血浆放-20℃保存,测前提取或提取后再置-20℃贮存;测定TNF-α按常规静脉取血2ml,注入试管中待凝固后,分离血清,置-20℃保存备用。
2.5 测定和标准曲线的制作 严格按照试剂盒操作步骤说明进行。
3 实验数据的处理
用SPSS11.5对所得资料进行统计学处理,结果用均数加标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,组内比较采用t检验。
4 实验结果
见表1。表1 各组大鼠血清TNF-α、SP含量比较注:与正常组相比,●P<0.01,●●P<0.001;与模型组相比,■P<0.001;与大剂量组相比,▲P<0.05;与中剂量组相比,※P<0.05;与小剂量组相比,★P<0.05
结果说明:脾阳虚大鼠血中SP、TNF-α含量明显升高,与正常组相比差异有显著性;用大建中汤治疗后能显著降低脾阳虚大鼠血中SP、TNF-α含量;大、中剂量组与西药消炎痛组之间的比较差异无显著性;小剂量组大鼠血中SP、TNF-α含量虽有降低,但无大、中剂量组明显。实验提示:(1)脾阳虚大鼠血中TNF-α、SP含量明显升高,可能是脾阳虚腹痛证候出现的病理基础之一;(2)大建中汤能显著降低大鼠血中SP、TNF-α含量,其镇痛机制可能与SP、TNF-α的降低密切相关;(3)大建中汤大、中剂量组疗效最佳,接近空白组,与西药组对照无明显差异,提示大建中汤中剂量已达到治疗大白鼠脾阳虚腹痛的有效剂量。
5 讨论
临床上脾阳虚引起的胃肠腹痛很常见,体内TNF-α、SP含量的升高在疼痛的发生发展过程中有着重要的意义。现已证实P 物质是致痛物质,是伤害性感受器本身含有的神经递质,当这些感受器被激活时,P 物质便从这些细纤维的末梢中释放出来,进入组织液刺激肥大细胞释放组胺,刺激血小板释放5-HT,后者再激活邻近的伤害性感受器,进一步增强其活动,导致在伤害性刺激停止作用后持久性疼痛和痛觉过敏的发展[4]。TNF-α也是与疼痛有关的细胞因子,当组织损伤和炎症时能激活免疫细胞,释放大量的可溶性信号分子,TNF-α就是其中重要的因子之一,在损伤局部的含量随着痛觉过敏的发展而升高。由于SP可促进TNF-α的产生,而TNF-α又能增强SP的合成和释放[4],加之TNF-α、SP各自能刺激其他的细胞因子[4,5],故认为在组织损伤和炎症时可能存在一种炎症扩大环路,TNF-α与SP在其中起着增强炎症反应和导致组织损伤的作用。所以说TNF-α和SP在疼痛的发生发展过程中起着至关重要的作用,是慢性疼痛的发病机制之一。
本实验结果表明,脾阳虚大鼠血中SP、TNF-α的含量明显升高,推测二者的升高可能与脾阳虚腹痛的病理变化密切相关。大建中汤治疗后,能够显著降低SP、TNF-α的含量,而且脾阳虚症状均有明显改善,饮食、体重、肛温恢复正常,故推测大建中汤降低SP、TNF-α含量是其治疗脾阳虚腹痛的作用机制之一。
【参考文献】
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作者单位:550002 贵州贵阳,贵阳中医学院基础部(△通讯作者)