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【摘要】 目的 评价银杏叶在癫痫神经细胞退行性变中的作用。方法 取成年大鼠40只，随机分成二组（银杏叶组处理组20只、未用银杏叶处理的对照组20只）。采用皮下注射海仁酸方法建立实验性癫痫大鼠模型，然后采用结晶紫染色方法观察实验性癫痫大鼠银杏叶组和对照组海马神经元的变性；采用免疫组织化学染色方法观察实验性癫痫大鼠银杏叶组和对照组MHC-Ⅰ、Ⅱ分子和补体C3bR的表达。结果 海仁酸诱导的实验性癫痫大鼠海马小胶质细胞表达MHC-Ⅰ类分子（平均密度为201.6±6.43）、Ⅱ类分子（平均密度为493.8±7.92）和C3b受体（平均密度为493.8±7.92），用银杏叶处理后，MHC-Ⅰ类分子（平均扫描密度为38.8±2.0）、Ⅱ类分子（平均扫描密度为21.3±2.45）和C3b受体（平均扫描密度为26.5±2.01）的表达均明显降低( P<0.01)。同时银杏叶还可阻止部分神经元退行性变。结论 银杏叶通过抑制免疫应答对实验性癫痫大鼠海马退行性变具有保护作用。
【关键词】 癫痫；免疫应答；银杏叶；免疫组化
癫痫（epilepsy）是一组慢性临床综合征，在长期病程中由反复发作的大脑异常放电所致的暂时性脑功能失调。癫痫持续状态是频繁而持续地发作，持续发作20min以后各种酶、神经递质、氨基酸等化学物质迅速变化，可导致脑水肿，甚至细胞死亡。癫痫的神经元损伤机制很复杂，许多研究表明癫痫发病过程具有免疫炎症性质［1］。
文献报道，老年性痴呆症患者服用银杏叶提取物（Ginkgo biloba extract）6个月后，对轻、中度患者的症状有缓解，服用52周后症状的改善均较安慰剂对照组显著，且无明显不良反应［2］。目前GbE已获得德国联邦政府卫生部门（BGA）的批准，作为治疗老年痴呆症的药［3］。我国临床应用GbE治疗脑动脉供血不足所引起耳鸣、眩晕等症取得满意疗效。治疗早老退化型痴呆较服用吡拉西坦、曲克芦丁、维生素E有效率显著［4］。但银杏叶对于与其发病机制相类似的癫痫的神经元损伤的作用至今尚未得到证明。笔者建立了实验性癫痫大鼠模型，观察了银杏叶对实验性癫痫大鼠海马小胶质细胞MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子和C3b受体的表达以及神经元的退行性变的作用，旨在进一步明确银杏叶对实验性癫痫大鼠的免疫保护作用。
1 材料与方法
1.1 材料 MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子单克隆抗体和C3bR 单克隆抗体购自英国SEROTEC公司；ABC购自加拿大Burlingame Vector实验室。银杏叶购自日本Wako化学工业公司。恒冷切片机为日本Yamato，Tochigi。银杏叶提取物：银杏叶片，每片含生药50mg，其中含银杏黄酮9.6mg，银杏苦内酯2.4mg。健康Wistar大鼠由吉林大学提供，所有大鼠置安静、避强光的环境中饲养。
1.2 方法
1.2.1 分组与模型建立 取成年大鼠(体重280～300g) 40只，随机分成二组（银杏叶处理组20只、未用银杏叶处理的对照组20只）。采用皮下注射海仁酸方法建立实验性癫痫大鼠模型，给大鼠皮下注射海仁酸的剂量为12mg/kg。海仁酸注射前给大鼠灌胃银杏叶提取物，剂量为100mg/kg。以Racine分类改良法为标准［5］，观察动物的行为变化。
1.2.2 组织切片的制备 用戊巴比妥钠（50mg/kg）皮下深麻醉，每只动物通过左心室灌注0.01mol/L PBS（pH7.4），然后，再灌注冰冷的灌注固定液。从头盖迅速取脑并切成5～6mm冠状块，然后用后固定液4℃固定2天。把组织放在0.1mol/L PBS（含15%蔗糖、0.1mol/L 叠氮钠）中4℃冷冻保护2天后，用恒冷切片机将每块组织切成20μm厚冠状切片。切片用不同的0.1mol/L PBST（含0.3%Triton X-100）漂洗4天。每个大鼠脑的其中一些切片直接用结晶紫染色。
1.2.3 免疫组织化学染色 实验性癫痫大鼠脑切片与0.1mol/L PBST（含0.5%H2O2）作用30min。用0.1mol/L PBST洗，10min×3次。分别与MHC-Ⅰ、Ⅱ单克隆抗体和C3bR 单克隆抗体4℃温育。用0.1mol/L PBST洗，10min×3次。与兔抗鼠IgG（1∶1000）室温作用2h。用0.1mol/L PBST洗，10min×3次。与ABC（1∶2000）室温作用1h。用0.1mol/L PBST洗，10min×3次。在DAB溶液中反应。用0.05mol/L Tris-HCl缓冲液终止反应。包被有明胶的玻片固定，水洗。用系列浓度乙醇脱水，二甲苯中透明，封边。
1.3 统计学处理 统计学分析采用SPSS软件，t检验方法。
2 结果
2.1 实验性癫痫大鼠行为状态 在对照组（12mg/kg），由海仁酸皮下注射引起的湿狗样变及抽搐发生在注射海仁酸3h以内，并且抽搐症状从第一阶段持续到第五阶段，但是从第3h到第6h出现更为剧烈的癫痫持续状态。在银杏叶组中，反复发作的抽搐状态滞后于海仁酸对照组，并且所展示的行为状态比对照组较为温和。
2.2 结晶紫染色结果 在对照组中，海仁酸皮下注射3天后，在大脑海马CA1和CA3区可观察到锥体细胞的变性或丢失，神经元皱缩，胞浆深染。在银杏叶组，可观察到CA1区中的锥体细胞被部分保存，形态似正常细胞，胞浆清晰淡染，核仁清楚。
2.3 MHC-Ⅰ类分子在实验性癫痫大鼠海马中的表达结果 在对照组中，在海马的锥状细胞层CA1、CA3区及齿状回发现大量表达MHC-Ⅰ类分子的阳性细胞，平均扫描密度为201.6±6.43。阳性细胞胞体丰满，突起增粗，表明海马神经元退行性变发生过程中有MHC-Ⅰ类分子参与。在银杏叶组，虽然发现活化的小胶质细胞和星形胶质细胞也表达MHC-Ⅰ类分子，但其表达的数量及密度(平均扫描密度为38.8±2.0)明显弱于对照组 (P<0.01)，说明银杏叶可以通过抑制MHC-Ⅰ类分子表达来抑制中枢神经系统中免疫反应的发生，保护神经元不受免疫系统的攻击。
2.4 MHC-Ⅱ类分子在实验性癫痫大鼠海马中的表达结果 在对照组，海马中可见大量表达MHC-Ⅱ类分子的阳性细胞，平均扫描密度为493.8±7.92。阳性细胞胞体肿胀，突起变短，变粗，表明海马神经元退行性变发生过程中有MHC-Ⅱ类分子参与。在银杏叶组，表达MHC-Ⅱ类分子的阳性细胞数量明显减少，且其表达的密度（平均扫描密度为21.3±2.45）明显弱于对照组(P<0.01)，说明银杏叶可以通过抑制MHC-Ⅱ类分子的表达来抑制免疫反应的发生，从而对神经元的丢失起到保护作用。
2．5 补体C3b受体在实验性癫痫大鼠海马中的表达结果 在对照组，海马中可见大量表达C3bR的阳性细胞，平均扫描密度为362.5±3.18。阳性细胞胞体膨大，突起变粗、变短，表明海马神经元退行性变发生过程中有补体系统参与。在银杏叶组，活化的小胶质细胞和星形胶质细胞形态与对照组相似，但其表达补体C3b 受体的数量和密度（平均扫描密度为26.5±2.01）显著减少(P<0.01)，说明银杏叶可以通过抑制补体系统活化来降低补体系统的攻击。
3 讨论
研究表明，脑的内源性免疫应答有小胶质细胞参与。癫痫患者和实验动物的小胶质细胞大量增殖，补体活化，T淋巴细胞浸润到大脑海马的锥体层［6］。这些招募来的血细胞与小胶质细胞结合，表明神经元早期损伤有炎症机制起作用。小胶质细胞可被大多数过程激活。一旦被激活，小胶质细胞形态发生改变，胞浆增加，突起变短、变粗，其表面表达多种与免疫应答有关的受体（如CR、IgGR）、MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子，并且也能产生许多细胞因子，导致炎症形成。这种炎症应答诱导了神经元的自我毒性循环［7］。因此，阻止脑内免疫应答的发生和炎症的形成可能为癫痫治疗开辟新的途径。
银杏叶提取物的主要成分为黄酮类和萜内酯类。黄酮类有效成分为黄酮甙，主要是山柰酚和颉皮素的葡萄糖鼠李糖甙。萜内酯化物分为银杏内酯和白果内酯。Rodriguez等［8］发现银杏叶提取物EGb761可以有效降低癫痫大鼠脑内皮层和海马区游离脂肪酸和甘油三酯水平，主要是通过影响脂类代谢和脂源第二信使释放发挥作用。EGb761能清除超氧阴离子、羟自由基、NO和脂质过氧化自由基，还能拮抗血小板活化因子(PAF)诱发的谷氨酸超常释放，对抗兴奋性毒性引起的形态和生化改变，使神经细胞对谷氨酸引起的神经毒性敏感性降低［26］。Gb是银杏叶提取物EGb761的一种活性成分，许多研究发现Gb对各种类型癫痫模型均具有神经保护作用。Weichel等［9］发现Gb可完全抑制NMDA致痫小鼠惊厥，还可抑制谷氨酸对细胞膜的兴奋毒性损伤，提示Gb有利于对脑缺氧和神经元过度活化的治疗。Davies等［10］发现Gb能增加GABA含量，从而减少谷氨酸的释放，提示Gb能有效减少兴奋性神经递质特别是谷氨酸的释放，因而具有神经保护作用。
在本实验中，海仁酸诱导的实验性癫痫大鼠海马小胶质细胞表达MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子和C3bR。用银杏叶处理后，其表达可明显降低。同时银杏叶还可阻止部分神经元退行性变。因此，可以认为银杏叶对实验性癫痫大鼠海马退行性变具有保护作用。其可能的机制如下：（1）银杏叶通过抑制C3bR的表达抑制免疫应答。补体经典激活途径中，首先激活C1，接着激活C4和C3，导致反应扩大和活化的补体成分固定到靶细胞上。如果共价结合的是碎片或入侵异物，就会发生调理作用。对于宿主组织，有可能发生旁观者损伤。银杏叶可通过抑制C3bR的表达阻抑补体经典途径的活化，从而抑制免疫应答；（2）银杏叶通过降低MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子的表达抑制免疫应答。MHC分子对于免疫应答非常重要。MHC-Ⅰ类分子限制Tc细胞识别抗原，MHC-Ⅱ类分子限制Th细胞识别抗原。银杏叶能抑制癫痫大鼠MHC-Ⅰ、Ⅱ类分子表达，使小胶质细胞表达加工抗原的能力则下降，因此免疫应答被抑制。
总之，银杏叶可通过下调免疫应答对实验性癫痫大鼠的神经元退行性变具有保护作用，其作用的特异方式有待进一步研究。
【参考文献】
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作者单位：1 133101 吉林图们，图们市石岘医院 2 132001 吉林吉林，北华大学医学院