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【摘要】 目的 寻找PA1b在哺乳动物细胞膜上的相互作用蛋白。方法 采用表面等离子体共振光学传感器，研究鼠胰腺细胞膜中与PA1b相互作用的蛋白。进一步采用亲和层析将此相互作用蛋白从猪胰腺细胞膜上纯化出来。并用ELISA实验证实，纯化胰腺细胞膜蛋白能在体外与PA1b结合。将纯化出的相互作用蛋白经SDS-PAGE分离，考马斯亮蓝R-250染色。切下染色蛋白条带，进行胶内胰酶水解，水解液经MALDI-TOF-MASS鉴定，得到胰腺细胞膜相互作用蛋白的肽指纹图谱，并在蛋白质数据库Mascot Search中查询。结果 发现一个与鼠胰腺细胞膜中与PA1b相互作用的蛋白，能在体外与PA1b结合。该相互作用蛋白为一个电压依赖性阴离子通道蛋白，分子量为30737Da。结论 该蛋白的鉴定，对植物多肽激素在哺乳动物体内的生理功能研究将起到重要作用。
【关键词】 豌豆胰岛素 相互作用蛋白 电压依赖性阴离子通道
Searching for an interactive protein of PA1b in mammalian
LI Fa-fang， DUN Xin-peng， CHEN Zheng-wang.Institude of Biochemistry and Biophysics, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074, China
【Abstract】 Objective To detect an interactive protein of PA1b on the cell membrane of mammalian. Method With surface plasmon resonance (SPR) biosensor analysis for the rat pancreatic cell membrane,the binding protein was purified from porcine pancreas by affinity chromatography. The interaction between the purified porcine pancreas proteins and PA1b was further verified by ELISA in vitro. After separated by SDS-PAGE and stained with Coomassie blue R-250, the protein band in the stained gel was excised and digested by trypsin, then the peptide mass fingerprint was analyzed by MALDI-TOF-MS. Results It has been clearly found that there is a binding protein existing in mammalian pancreatic cell membrane. The resultant peptide mass fingerprint was searched in data base of Mascot, which showed that this protein is the voltage-dependent anion channel 1 (VDAC 1), and the molecular weight is 30737Da. Conclusion The identification of the interactive protein of PA1b on cell membrane will play an important role in the research of those plant hormone’s function in mammalian.
【Key words】 PA1b;interactive protein;voltage-dependent anion channel
19世纪20年代发现胰岛素以来，多肽激素作为胞外信号分子对动物生理活动的调节机制已有较为深入的研究。1991年系统素被发现后［1］，人们认识到，植物界同样可利用多肽激素作为信号分子。豆类胰岛素是豆类种子中的一大类调节肽［2］。豌豆种子中含37个氨基酸残基、分子量约为4000Da的多肽(pea albumin 1b，PA1b)，在高级结构上，它属抑制型胱氨酸结构模体，含这种结构膜体的多肽往往具有多种生理功能。研究发现，豆类胰岛素的受体BG蛋白在高级结构上和胰岛素受体存在相似性，并且发现，动物胰岛素、IGF-I或IGF-II能和这个豆类胰岛素竞争结合BG蛋白［3］。进一步研究发现，豆类胰岛素在高级结构上，疏水残基的排列方式与胰岛素具有相似性。这样，暗示豆类胰岛素可能对哺乳动物的血糖具有调节作用。多肽激素往往都是通过与受体相互作用而行使相应的生理功能。本研究采用豌豆胰岛素作为固相配基，从哺乳动物中发现一个相互作用蛋白，并且将其分离纯化出来，经鉴定为一个电压依赖性的阴离子通道蛋白。本研究属首次报道植物多肽激素在哺乳动物中也存在相互作用蛋白，为今后植物多肽激素应用打开了广泛的前景。
1 实验仪器
蛋白层析仪(AKTA Prime, Pharmacia biotech)；冷冻干燥机(Thermo savant)；高速冷冻离心机；基质辅助激光解吸离子化质谱(军事医学科学院)；层析柱；表面等离子体共振光学传感器(北京航天医学工程研究所)；蛋白质凝胶电泳仪(Bio-rad)；酶标仪(Sunrise)等。
2 实验方法和试剂
2．1 表面等离子体共振光学传感器（SPR）筛选胰腺细胞膜蛋白
2．1．1 PA1b的固定 按照仪器和芯片的标准方法将PA1b固定到SPR传感器芯片上。
2．1．2 膜结合蛋白制备
2．1．2.1 溶液的配制(4℃保存) （1）缓冲液A：50mM Hepes(pH7.6)，含1mM DTT，1mM PMSF 1mM EDTA，0.02%NaN3；（2）缓冲液B：缓冲液A，含0.25 M蔗糖和鸡尾酒的酶抑制；（3）缓冲液C：缓冲液A，含1% Triton X-100和鸡尾酒蛋白酶抑制剂；（4）缓冲液D：缓冲液A，含0.1% Triton X-100；（5）缓冲液E：缓冲液D，含1 M的NaCl；（6）缓冲液F：50 mM的乙酸钠(pH5.0)，含1 M NaCl，0.1% Triton X-100，1 mM DTT 和0.01%NaN3；（7）缓冲液G：缓冲液F，含1.5 M的尿素；（8）收集液：0.5M的Tris-HCl(pH8.25)；（9）透析液：10 mM Hepes(pH7.6)，含1 mM DTT，0.02%NaN3，0.1% Triton X-100。
新鲜鼠胰腺、肝脏、肾和肌肉组织各6g，用预冷至4℃的均浆液（50mM Tris-HCl，1mM EDTA，1.8mg/ml碘代乙酰氨，1mM DTT，0.5mM PMSF，鸡尾酒蛋白酶抑制剂，甘油少许）洗净，在冰上剪成碎片。各加入15ml均浆液，道恩斯匀浆器匀浆1min后于在3500×g，低温离心15min取上清，上清于15000×g、低温离心30min再取上清，然后于200000×g、低温离心30min取沉淀。沉淀用用膜蛋白溶解液（50mM Tris-HCl，含1mM EDTA，1.8mg/ml碘代乙酰氨，1mM DTT，0.5mM PMSF，鸡尾酒蛋白酶抑制剂，1%的Triton-x 100，甘油少许）均浆，在室温下搅拌40min后于200000×g、低温离心30min取上清，测定蛋白浓度，然后用于结合测定［4］。
2．1．2.2 亲和柱的制备 （1）将aglycin以5mg/ml溶于偶联缓冲液(0.1mol.L-1NaHCO3，0.5mol/L NaCl，pH8.3)，取少量以偶联缓冲液为对照测定OD值(280nm)。（2） 称取需要的CNBr活化的Sepharose 4B 1.5g（1g干胶可获得3.5ml的溶胀胶）于1mmol/L的HCl里轻轻搅拌15min，介质会膨胀。然后在玻璃漏斗里，每次用1mmol/L HCl 至少100ml清洗溶胀胶3次。
2．1．3 膜蛋白结合与检测 四种组织的膜结合蛋白用以上PBS缓冲液稀释至最终浓度为200μg/ml后，每种取1ml装入样品管中，在25℃的恒定温度下，用恒流泵以20μl/min持续使样品流经芯片2～3min。每次样品注射完后，用PBS缓冲液洗芯片。在线监测结合反应，并以折射率为纵坐标，时间为横坐标自动作出结合反应图。
2．2 相互作用蛋白的纯化与鉴定 亲和层析，4℃下用10倍体积的缓冲液D平衡偶联PA1b的Sepharose4B亲和柱。膜蛋白的结合、洗脱、收集及透析如下：稀释膜蛋白提取液以低流速循环上柱四次后。先用缓冲液D洗柱至吸收值回到基线，再用缓冲液E彻底的洗去杂蛋白。吸收值回到基线后，先用缓冲液A洗脱，再用缓冲液B洗脱，检测波长254nm。洗脱液用1ml试管收集，按洗脱峰合并，然后用截留分子量大小为8～10kD的透析袋于4℃透析12h，其间更换透析液3次。冷冻干燥，用于膜结合蛋白分析。
2．3 ELISA检测 各溶液的配制参考Deutecher（1990年）操作［5］。PA1b单克隆抗体（本实验室自己制备）。检测原的制备如下：称取甲状腺球蛋白(BTG)5mg，溶于0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4，含0.9% NaCl和0.1% SDS)中，加入1mg的碳二亚胺（EDC）混匀后，再加入1mg的PA1b (溶于0.5ml PBS)，边加边搅拌，4℃反应16h以上，柱纯化，测浓度后分装，冻存。
分别用亲和层析获得的峰A、B包被酶标板，加阴性血清和阳性血清，以此鉴定特异性结合蛋白。阴性对照为仅以缓冲液标板,阴性对照用PA1b包被酶标板,此进行ELISA实验来鉴定特异性结合蛋白。
2．4 膜结合蛋白鉴定 样品虽然已经透析过，但冻干后高度浓缩，依然含有较高浓度的盐和Triton X-100，甲醇/氯仿除去盐和Triton X-100后，可获得理想的电泳结果［6］。
2．4．1 SDS-PAGE电泳鉴定膜结合蛋白的分子量 取一定量的冻干样品用超纯水溶解，从溶解样品中取1ml于10ml的小离心管中，加入4ml的甲醇，涡旋充分振荡后于9000×g离心30s，加入1ml氯仿，涡旋充分振荡后于9000×g离心30s，然后加入3ml的超纯水，再次涡旋充分振荡后于9000×g离心1min，分层，下相为氯仿，上相为水和甲醇的混合物，蛋白介于二者之间，小心除去上相，最后再加入3ml甲醇，混均后于9000×g离心2min，除去上清液，沉淀于常温真空干燥后用于膜结合蛋白的鉴定。
2．4．2 胶上水解与水解产物的鉴定 切下蛋白条带脱色后，在胶内进行胰酶水解，取水解液用MALDI-TOF-MS鉴定被水解蛋白的肽指纹图谱，在蛋白质数据库中查询相匹配的蛋白［7］。
3 实验结果
3．1 在SPR传感器芯片上固定PA1b 芯片固定以后，用原子力显微镜对固定效果进行检查（图1和图2）。结果表明，PA1b在金膜上固定成功，可用以膜结合蛋白的鉴定。
3．2 SPR传感器检测胰腺PA1b膜配体 PA1b固定以后，用小鼠胰腺膜蛋白提取液流经芯片，RI值明显升高，洗脱后，肌肉、肝和肾的RI值都回到基线，而两次胰腺组织都没有回到基线水平。第二次加入胰腺组织膜蛋白提取液能引起洗脱后的基线升高，说明第一次结合未饱和。SPR实验结果表明，胰腺组织中可能存在一个PA1b的结合蛋白。见图3。
图3 四种组织膜表面折射率（RI）的变化
(PMP：胰腺膜蛋白，LMP：肝脏膜蛋白，KMP肾膜蛋白，MMP：肌肉膜蛋白)
3.3 亲和层析 亲和层析的关键在于亲和介质与配体偶联的效果及目的蛋白的提取。本次实验偶联前含PA1b的溶液OD值分别为1.426和1.549，而偶联后溶液的OD值分别为0.049和0.071，偶联效率均在95%以上。
图4 猪胰腺膜蛋白亲和层析 亲和层析特异性结合蛋白洗脱峰见图4。从图4中可以看出，经缓冲液D和E洗柱后，吸收值回到了基线，这一步主要目的是彻底洗去杂蛋白。当用缓冲液F进行膜结合蛋白的洗脱时出现1个较小的峰。用缓冲液G含有1.5mol/L尿素，洗脱时出现一个较大的洗脱峰。
3．4 ELISA检测洗脱峰的结合特性 酶联免疫结果说明，峰B能与PA1b特异结合(见图5)。
3．5 膜结合蛋白鉴定 从图6可以看出，两个峰的电泳结果相同。以蛋白质Marker为分子量标准，根据蛋白条带的迁移率相对于分子量的对数作标准曲线，经计算，带的分子量为33.7kDa。
3．6 膜结合蛋白的胶内水解肽指纹图谱 图7为SDS-PAGE分子量为33.7kDa蛋白的肽指纹图谱，根据指纹图谱在www.matrixscience.com的 Mascot search中用Peptide Mass Fingerprint进行查询，该蛋白为电压依赖性阴离子通道蛋白-1(voltage-dependent anion channel 1, VDAC 1)［8］。
图5 ELISA检测各洗脱峰与PA1b特异结合
图6 猪胰腺亲和层析洗脱峰的
SDS-PAGE分离条带图7 30.7kDa蛋白的肽指纹图谱4 讨论
PA1b属于ICK结构模型的多肽。从文献报道来看，ICK结构模型的多肽大都是与离子通道相关的毒素，但多与钠离子、钾离子和钙离子等阳离子通道蛋白相关［9］。据报道，PA1b在昆虫体内有高亲和位点，可以作为毒素起杀虫作用，但未鉴定该结合位点为何种蛋白［10］。
本文报道了猪胰腺细胞膜上一个PA1b在哺乳动物中存在的一个相互作用蛋白——电压依赖性阴离子通道蛋白(VDAC)。一直以来，人们都认为VDAC位于线粒体外膜［11］，现在发现哺乳动物的细胞膜中也大量存在VDACs［12～14］。研究表明，当表达的VDAC的N端含有信号肽时，VDAC定位于细胞膜，当表达VDAC的N端不含信号肽时，VDAC则定位于线粒体外膜。在线粒体外膜上，VDAC能形成一个3nm左右的腺嘌呤核苷酸通道，调节线粒体内、外ATP和ADP的平衡，是己糖激酶和甘油激酶的结合位点。对于VDAC存在于细胞膜表面的功能，仅有一篇文献报道，可能与细胞体积的调节有关［14］。
本实验所提取的VDAC来源于细胞膜而非线粒体膜。因为本实验采用12000g，15min的离心条件除去线粒体、高尔基体和细胞核，而线粒体在10000g，10min的离心条件下就会完全沉淀下来。本次分离鉴定的阴离子通道蛋白是从整个胰腺组织细胞膜获得的，还没有明确的证据表明这个阴离子通道蛋白就来自于胰腺β细胞膜。PA1b能够与哺乳动物中的VDAC结合，具体的生理功能还有待进一步研究。
（致谢：本研究得到了北京航天医学工程研究所和湖南师范大学的大力帮助，在此表示感谢。）
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(编辑：齐 永)
作者单位：*基金项目：国家高新技术863计划（2002AA214061） 1 430073 武汉湖北，华中科技大学生物物理生物化学研究所 533000 广西百色，右江民族医学院科学实验中心 S-171 77 瑞典，卡罗林斯卡研究所