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首页医源资料库在线期刊中华医药杂志2007年第7卷第8期

肝细胞移植的临床应用

来源:《中华医药杂志》
摘要:Berry和Friend等在1969年用自己配置成的消化液进行大鼠肝灌注第一次完整分离肝细胞。几十年来,肝细胞的分离培养及保存技术不断优化并为相关的肝脏研究和肝脏疾病的治疗提供了极为宝贵的途径。尤其是近年来肝细胞移植的实验和临床应用不断取得进展,为肝脏疾病的治疗展现了诱人的前景。优化和完善肝细胞的分离,培养和保......

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【摘要】  50多年前Sorrentino第一次用机械的方法把新鲜肝组织制成匀浆,并在体外进行药物实验,开创了肝脏功能的体外人工支持时代。Berry和Friend 等在1969年用自己配置成的消化液进行大鼠肝灌注第一次完整分离肝细胞。几十年来,肝细胞的分离培养及保存技术不断优化并为相关的肝脏研究和肝脏疾病的治疗提供了极为宝贵的途径。尤其是近年来肝细胞移植的实验和临床应用不断取得进展,为肝脏疾病的治疗展现了诱人的前景。优化和完善肝细胞的分离,培养和保存,仍然是关系到肝细胞移植效果的前提。近年来,不少的研究者正致力于临床的应用研究。根据所收集到的文献报道,世界各大医学中心目前已有近80例肝细胞移植的临床应用,其结果令人鼓舞。可以预测,肝细胞移植作为整体器官移植的“桥梁”或替代治疗,将给众多肝病患者带来福音。本文就近年来肝细胞移植的临床应用研究进展作一综述。

【关键词】  肝细胞 分离 细胞培养 移植 临床应用


    肝脏是机体最重要的器官之一,在生理和病理状态下,它是能量代谢、解毒以及血浆蛋白合成的中心。当发生急性肝功能衰竭时,只有15%~25%的病人得以生存[1]。许多慢性肝脏疾病如肝硬化肝癌等也最终导致肝脏功能的衰竭。长期以来,国内外学者注重于肝器官移植的研究, 因为肝移植疗效显著,1年存活率可达70%以上。但肝移植对技术条件、适应证及组织相容性等要求较高, 加之肝供体的短缺,使肝移植的临床应用严重受限。因此,临床上急需其他方法,作为“桥梁”来缓解和改善肝功能,延长患者的生存时间,而等待肝移植,甚至取代肝移植。由此,肝细胞移植及生物人工肝的研究成为热点[2,3]。不管是肝细胞移植或生物人工肝,肝细胞的分离、培养和保存是肝细胞临床应用的基石。就肝细胞分离培养和保存尤其是肝细胞移植的临床应用研究进展现综述如下。

    1  肝细胞分离培养与保存

    1.1  肝细胞的来源

    1.1.1  人肝细胞  人类肝脏细胞是最好的供体,因为肝脏细胞分化较高,有较好的合成和代谢功能[4] ,因此肝细胞移植首选人肝细胞。但由于供体的严重短缺,目前用于肝细胞移植的供体多为不适于肝移植供体(untransplantable liver),如脂肪肝、纤维化肝、受外伤肝等,这些细胞体外培养增殖困难,肝细胞功能效果不理想。胎肝细胞(fetal liver cell,FLC)在体外可以扩增,在刺激下可分化,免疫原性弱。取自妊娠26周和34周引产的胎肝细胞, 检测其活性为95%, 代谢能力为成人的75%[5] 。但其来源也很受限,且存在伦理问题。

    1.1.2  动物肝细胞  为解决供体缺乏的问题,多年来研究者正致力于异种肝细胞移植的研究。动物肝细胞来源广泛,分离简便,效果可靠,Donato等[6]测定了人肝细胞、猪肝细胞、犬肝细胞、兔肝细胞、鼠肝细胞等钆细胞中细胞色素P450的含量及代谢能力,猪肝细胞和人肝细胞的代谢功能最接近。然而异种移植用于临床仍有许多问题待解决。其一,猪肝细胞的内源性逆转录病毒感染受体,其安全性须进一步研究。其二,动物肝细胞不可能替代人类血浆蛋白合成酶活性,并存在有种间的特异性差异,并且异基因蛋白和酶进入到血循环中也能产生副作用[7];为避免这种差异反应,病人血液和动物肝细胞之间必须有安全屏障,即半透膜的存在。故目前动物肝细胞多作为生物人工肝的生物成分而起作用[8]。

    1.1.3  肝干细胞  1958年Wilson和Leduc[9]提出肝干细胞的概念。近年来,研究发现肝干细胞移植对急慢性肝脏疾病有一定的治疗作用,使之成为肝脏领域的研究热点[10] 。根据肝脏干细胞起源的不同,可将其分为肝源性肝脏干细胞和非肝源性肝脏干细胞,前者包括卵圆细胞、分化的肝细胞、胚胎肝细胞和胆管上皮细胞,后者则为源于胚胎干细胞、骨髓造血干细胞及胰腺上皮干细胞等不同来源的肝脏干细胞。在特定条件下,造血干细胞和骨髓间充质细胞均可转化成肝细胞。

    动物实验证实, 肝干细胞在急性肝损伤时参与了肝脏肝细胞的再生和修复,并发挥了至关重要的作用,这样使肝干细胞移植用于临床治疗急性肝衰竭及肝代谢性疾病成为可能[11]。但肝干细胞用于临床还有许多问题待解决,诸如肝干细胞在体外的鉴别、分离、培养及筛选,干细胞的多向分化潜能及可塑性这一生物学现象的发生和调控机制仍不清楚,干细胞移植的数量,移植后在体内的归巢及定位等。相信随着研究的深入,肝干细胞希望能代替肝细胞的作用并应用于临床治疗。

    1.2  肝细胞的分离和培养

    1.2.1  肝细胞的分离  1969年,Berry和Friend 等人用无钙的平衡盐、胶原酶和透明质酸酶配置成的消化液进行大鼠肝灌注,获得到肝细胞。之后,Seglen 创立了两步灌流法,即首先灌注预热的无钙的平衡盐溶液去除肝血窦内的血细胞及部分非实质细胞,然后再灌注含有胶原酶的平衡盐溶液,进行体外消化后,分离提纯而获得肝细胞。目前,国内外动物和人类肝细胞的分离方法都是在此基础上改良的。

    1.2.2  肝细胞的培养   肝细胞属高度分化类上皮细胞,对生存环境有着极高的要求,如培养液的温度、pH值、渗透压、CO2含量、促肝细胞生长物质及血清浓度等,是影响肝细胞活性的重要因素;肝细胞与基质、肝细胞与非实质细胞的接触对肝细胞的生长和活性也起着极为重要的作用[13]。肝细胞的培养须考虑到这些方面的问题。

    随着临床肝细胞移植及生物人工肝技术的研究和应用,需对肝细胞进行大量培养。在培养的容器中加入细胞外基质或载体,以尽可能模拟肝细胞生长的三维环境,对维持细胞形态、功能和活性有着重要作用。目前培养的方法主要有:(1)单层胶培养(monolay);(2)胶原凝胶三明治结构(collagen gel sandwich configuraton);(3)微载体粘附培养(microcarrier culture),通过载体,使肝细胞成球形,扩大了细胞的交换面积,有利于肝细胞结构和功能的稳定;(4)微囊培养 (microcapsule culture) ,于微囊膜阻止了大分子物质(抗体、病毒)的通过,既保证了细胞营养,又起到免疫隔离作用;(5)中空纤维管培养(hollow fiber culture),肝细胞借助管壁上的微孔与培养液相通,用于生物人工肝的治疗[14]。

    1.3  肝细胞的冻存     为缓解供体器官的严重短缺,建立用于急诊肝细胞移植治疗所需的“肝细胞库”,肝细胞冻存技术是关键。一般认为,低温冻存细胞的效果,取决于冷冻保护液、降温升温的速度和方式、贮存温度和贮存时间的长短等[15]  。Jamal等[16] 通过对鼠肝细胞的冻存及复苏研究发现,冻存肝细胞活性较新鲜细胞明显下降(50%对70%),但冻存的鼠肝细胞在体内仍保持着增殖活性。Makowka 等[17]用-70℃低温冰箱保存肝细胞,保存120天活性保持在50%~60%。最近,Koizumi 等[18] 利用包胶囊法深低温保存鼠肝细胞,发现能够长期保持鼠肝细胞的药物代谢功能。任何冻存方法的最终目的是最小化可以损伤细胞亚结构的细胞内冰晶形成,从而保持解冻后细胞活性、粘附能力及代谢活性。人肝细胞的冻存目前尚没有一个标准的方法,国内外研究者积极致力于此领域的探索;温度的控制目前主要有计算机控制型冷冻仪实现的阶梯式降温法和普通的- 20℃然后- 80 ℃两步降温法;Guillouzo等[19]报道两者并无差异。国内郭跃虎等[20]报道用苦参碱与保护基剂二甲亚砜(DMSO)联合使用取得较好效果。相信随着科研的深入,肝细胞冻存技术不断提高,一定能建立起理想的“肝细胞库”,用于临床肝细胞移植及生物人工肝治疗急性肝功能衰竭。

    2  肝细胞移植的临床应用

    2.1  肝细胞移植途径   与肝移植相比,肝细胞移植简单易行,可通过微创手术或介入置管完成。目前主要的移植部位有:(1)门脉或肝内移植:从生理环境到细胞环境,肝脏是肝细胞的最佳生活空间。肝脏的组织结构,门脉血供的营养物质和生长因子以及激素,使得移植的肝细胞在不改变微结构的情况下与受体肝组织融合,肝功能能得到代偿。使用本途径较为安全,是较为常用的方法[21],但偶会出现门脉高压及肺栓塞的风险。(2)脾内移植:脾内网状组织有俘获和保护移植肝细胞不被吞噬细胞吞噬的作用,有利于细胞着床。同时脾内丰富的血供也为肝细胞的长期存活、增殖提供了有利条件。进一步的研究还发现, 肝细胞脾内移植可诱导特异性异体蛋白耐受。 在肝硬化成年患者,其脾脏较大约800~1200g, 而急性肝衰患者脾脏约100~150g。故对于慢性肝衰患者,脾内植入6亿~60亿肝细胞途径相对安全和容易操作[22]。但脾脏移植细胞也有引起门静脉高压症及右心房压力升高并发症的可能性。(3)其他途径:如腹腔、肠细膜、皮下等。通过微创腹腔内肝细胞移植,肝细胞可存活10天以上。但腹腔移植可引起炎症反应及腹腔感染,且移植细胞的血管化需较长时间。总之,几种移植途径各有优缺点,目前的临床试验主要采用门脉肝内移植及脾内移植途径。

    2.2  肝细胞移植的临床效果   肝细胞移植目前主要应用于爆发型肝功能衰竭以及肝相关性代谢性疾病,能有效地提供近期或者远期肝功能支持[23,24]。研究表明[25],移植后,肝细胞仍能维持正常的光镜和电镜结构,并能表达多种肝细胞功能,如白蛋白合成分泌、氨代谢、糖原储存和酵解、胆红素结合及细胞色素P450酶基因表达等。Soriano等[35]用real-time PCR的方法检测了供肝肝细胞的数量,同时通过对急性肝衰病人移植后的肝活检,证实移植肝细胞在肝板及胆小管的浸润,这说明门脉内移植的肝细胞不仅可增殖分化,而且利用缝隙连接同受体肝细胞相连,通过毛细胆管分泌胆汁。

    作为整体器官移植的桥梁或替代治疗,肝细胞移植显示出很大价值和应用前景。结合文献报道,现将收集到的临床人肝细胞移植效果作一总结。

    2.2.1  治疗遗传性肝脏代谢性疾病   临床研究证明,肝细胞移植用于治疗遗传性肝脏代谢性疾病具有较好的效果。Grossman等对21例遗传性肝脏代谢性疾病患者行肝细胞移植治疗[26~32],见表1。5 例接受治疗的家族性高胆固醇血症患者行肝左外叶切除后,体外分离肝细胞,利用反转录技术导入LDL蛋白受体基因,再由门脉移植入肝脏,移植5~6 天后发现移植肝细胞增殖,2周时达到峰值。随访2年,平均血清胆固醇下降20%,移植肝细胞及转基因的功能存在,无1例肿瘤和感染发生。表1  肝细胞移植用于治疗遗传性肝脏代谢性疾病Hughes等对4例Crgler-Najjar综合征患儿按整肝细胞量的5%输入新鲜和深低温保存的肝细胞,移植后高胆红素平均下降了30%~50%,降低了核黄疸的发生,随访显示结合胆红素水平保持稳定水平达3年以上。

    患有凝血因子Ⅶ缺乏症的两兄弟,在接受整肝细胞量5%新鲜肝细胞及冻肝细胞移植(10亿新鲜肝细胞,22 亿冻肝细胞),结果显示凝血功能明显改善,对外源性因子Ⅶ的依赖性减少了80%, 由于静脉通路产生的并发症(两位患者均发生了导管相关性败学症)以及肝细胞移植长期疗效的不确定性稳定性,半年后所需外源性因子Ⅶ的量增加,提示移植肝细胞功能丧失,接受了肝脏移植。2例1A型糖原储存障碍儿童患者,经肝细胞移植治疗后(第1周输入30亿,1个月后再次输入30亿肝细胞)开始正常饮食而血糖水平稳定。其中1例患儿葡萄糖6-磷酸激酶活性在移植后3周恢复到正常水平,并一直保持到7个月。

    1例患先天性Refsum 综合征的4岁患儿,经门脉行肝细胞移植(1 周内分8次输入总量20亿新鲜及冻存肝细胞),检测发现总胆酸下降,肝内胆汁淤积症状缓解,稳定到18个月后活检证实移植的肝细胞仍保持活性。

    4例患有鸟氨酸缺陷症儿童分多次分别输入总量达10亿、40亿及19亿的肝细胞,其中2例移植后血氨保持正常至11天时行肝脏移植术;另1例移植后进蛋白质饮食血氨仍保持正常水平,7个月时行肝脏移植。1例5岁患儿,移植后28天活检时鸟氨酸氨甲酰转移酶仍有活性,但42天时死于败血症。

    然而,在对2例患有家族性胆汁淤积症的儿童行肝细胞移植后没有取得疗效,分别在5个月和14个月后行肝移植术。分析原因可能与肝硬化程度较严重及输入细胞量不足有关。

    结合以上病例可看出,肝细胞移植用于治疗肝相关性代谢性疾病的临床研究取得了乐观效果,但长期稳定可靠的效果尚待进一步的观察和研究。 

    2.2.2  治疗慢性肝脏疾病肝衰  实验证明[33],肝细胞移植可明显改善慢性肝病肝衰所致的胆汁淤积高血氨并改善肝性脑病。从以下20例(17例成人,3例儿童)接受肝细胞移植的慢性肝病肝衰患者的治疗效果也得到证实[34~38],见表2。

    3例原发性肝纤维化肝衰的患儿,分别由股动脉和门静脉输入肝细胞后(移植量分别为7亿、5亿及5千万),血氨水平及肝性脑病得到临床控制达6周。其中2例成功过渡到肝移植而治愈,而另1例因颅内出血而于移植后7天死亡。

    7例肝硬化(Childs C级)肝性脑病Ⅲ~Ⅳ级患者行同种异体肝细胞脾内移植(6亿),其中2例移植后2天检查发现肝细胞在脾内形成肝样微结构,即“肝脾化”,患者临床症状得到明显缓解 。另5例酒精性肝硬化肝衰患者,行肝细胞脾内移植,5例生化指标改善,肝性脑病得到控制;其中1例移植后50天因多器官功能衰竭死亡,这可能和细胞移植的时机有关。

    然而,10例慢性肝病(Childs A~C级)患者经自体肝细胞(切除肝硬化的左肝外叶分离获得)移植入脾内(2千万~2亿不等),从第1个月到第6月检测放射性核素Tc99m标记发现脾内肝细胞生长,但并未改善患者的肝性脑病,这可能与供体质量有关。 表2  肝细胞移植用于治疗慢性肝脏疾病

    2.2.3  治疗急性肝功能衰竭     印度的Habibullah[39]等首次报道了7例急性肝功能衰竭患者行腹腔内胎肝细胞移植后存活率得到改善。十多年来又有30余例急性肝衰患者接受了肝细胞移植[40~42]。目前已报道的37例急性肝衰患者见表3,年龄从3.5个月~69岁,其中,药物性急性肝衰患者20例,分别接受了1~4次肝内、脾内及腹腔内肝细胞移植,所有患者移植后血氨及总胆红素等生化指标明显改善,肝性脑病等临床症状改善,其中3例完全恢复而未进行肝移植术,3例行原位肝移植而治愈,其他患者在首次移植后8h~35天死亡。从预后看肝细胞移植用于治疗药物性急性肝衰结果并不令人满意,这可能与患者年龄结构(5例未成年人中4例死亡)、移植细胞数量、移植时机及原发疾病严重程度等因素有关,见表3。

    Soriano等对6例原发性肝衰患者经门脉(4例)、腹膜内(1例)及脾脏(1例)行肝细胞移植,2例治愈而未行肝移植,2例在移植后第1天及第4天行原位肝移植术而康复;2例死亡病例中,1例经脾内2次肝细胞移植后(2亿,1.5亿),第5天行肝移植术,在第13天因败血症和多器官功能衰竭而死亡;1例Reyes综合征患者经门脉移植7亿肝细胞,1天后脑死亡,这可能与原发脑水肿较重而移植较晚及移植细胞量不足有关。

    9例病毒性肝炎急性肝衰和多器官功能衰竭的患者,分别行门脉、脾内及腹膜内肝细胞移植后,2例成功桥接到肝移植,而1例仅行肝细胞移植而最终治愈。

    1例64岁妇女因严重的蘑菇中毒经门脉输入49亿肝细胞1天后血氨等各项生化指标明显改善,肝性脑病由原来的4级转为3级,从12周开始停止了免疫抑制治疗,最终完全康复。

    Strom等报道,1例70岁患者肝三段切除后急性肝衰,分两次经脾动脉行肝细胞移植术(3.6亿~1.7亿),生化指标有改善,因原发病较重及年龄等因素,移植2天后死亡。

    在以上临床试验的病例中,1例出现脾静脉栓塞、2例肺栓塞以及1例肠细膜静脉栓塞,但未见门静脉高压症及右心房压力升高等并发症的报道。从以上临床资料来看,预后不甚理想有多种原因,诸如病例选择、细胞移植时机等;但肝细胞移植作为急性肝衰的治疗手段之一,不仅可改善急性期肝功能的状况,起到较好的支持作用,而且可刺激病肝细胞的恢复及肝小叶结构的重建,展现出广阔的前景。  表3  肝细胞移植用于治疗急性肝功能衰竭

    综合以上78例临床试验可看出,肝细胞移植对遗传性肝脏代谢性疾病可通过新分离的肝细胞或基因修饰的肝细胞做肝脏直接的基因治疗,有望取代整肝移植,具有美好前景;而对于慢性和急性肝病肝衰患者,肝细胞移植可修复和重建肝功能或桥梁治疗等待行原位肝移植,不失为肝衰的治疗手段之一。近年来,国内杨永平等[43]给7例重型肝炎患者行体内肝细胞移植术,取得较好效果,令人鼓舞。诚然,肝细胞移植的临床运用仍存在许多问题,诸如供肝的严重缺乏、肝细胞的分离纯化技术(特别是不适用于肝移植肝的分离纯化)、肝细胞的保存、肝细胞移植的移植途径、数量、方式及免疫抑制治疗,移植后的一些并发症,如血管栓塞、病毒感染、药物及全胃肠外营养时的肝毒性[44],伦理学因素及患者对此技术的接受程度等,很大程度上限制了肝细胞移植的广泛开展。世界各国学者目前正致力于此领域的研究,如永生化肝细胞或肝细胞系、异种肝细胞、胎肝细胞等。近年来对肝干细胞的研究和应用,为细胞治疗开辟了新的领域。相信,随着研究的深入及存在问题的解决,肝细胞移植与肝脏移植一样,必将给世界肝病的治疗开创新的纪元。

 

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作者单位:650051 云南昆明

作者: 李汝红 2008-7-4
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