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首页医源资料库在线期刊中华医药杂志2007年第7卷第11期

高效液相色谱法测定左亚叶酸钙注射液有关物质的条件研究

来源:《中华医药杂志》
摘要:【摘要】目的建立左亚叶酸钙注射液有关物质测定方法。结果左亚叶酸钙质量浓度为0。结论方法专属性好,准确,灵敏,用于左亚叶酸钙注射液有关物质测定结果可靠。左亚叶酸钙注射液。...

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【摘要】  目的 建立左亚叶酸钙注射液有关物质测定方法。方法 采用反相离子对试剂高效液相色谱法,色谱柱为Varian C18 (250mm×4.6mm,5μm),流动相:(磷酸氢二钠2.2g加10%四丁基氢氧化铵8ml,以水稀释到780ml,用1→10磷酸调节pH至7.8):甲醇为78:22;流速:1.0ml/min;柱温:40℃;检测波长286nm。结果 左亚叶酸钙质量浓度为0.04~120μg/ml内,线性关系良好(r=0.9999)。结论 方法专属性好,准确,灵敏,用于左亚叶酸钙注射液有关物质测定结果可靠。

【关键词】  高效液相色谱法;左亚叶酸钙注射液;有关物质;10-甲酰叶酸


    Determination the related substances in calcium levofolinate injection by RP-HPLC

    SONG Jian-mei. Zhejiang Provincial Yaojiang Pharmaceutical Co.Ltd,Hangzhou 310053,China

    【Abstract】  Objective  To establish the method to determine the related substance in calcium levfolinate injection.Methods  The RP-ion pair HPLC methods was used,use a Varian C18 column (250mm×4.6mm, 5μm),the mobile phase consisted 0.8mg/ml tetrabutyl aminourium hydroxide acid and 2.2g disodium hydrogen phosphate,adjusted to pH 7.8 with 1→10phosphoric acid:methanol 78:22,at a flow rate of 1.0ml/min,the temperature of the column was 40℃,detection wavelength was 286nm.Results  The linear calibratien curves obtained in concentration range of 0.04~120μg/ml at calcium levfolinate (r=0.9999).Conclusion  The method is simple,accurate,sensitive and reliable for determination the related substance in calcium levofolinate injection.

    【Key words】  HPLC;calcium levofolic acid injection; related substance;10-formylfolic acid

    左亚叶酸钙注射液是采用经手性拆分亚叶酸钙后所得左亚叶酸钙原料药配制而得的一种手性药物注射剂。其广泛用于贫血肿瘤的治疗。该品种是安徽省科隆药物研究所研制的一个新药。原有的HPLC有关物质测定方法色谱条件为:C18柱(250mm×4.6mm,5μm), 流速1.0ml/min,柱温:40℃,流动相:(磷酸氢二钠2.2g加10%四丁基氢氧化铵2ml,以水稀释到780ml,用1→10磷酸调节pH至7.5):甲醇为78:22,供试液浓度:0.14mg/ml。但是在用该色谱条件进行测定左亚叶酸钙注射液有关物质时,发现杂质峰没能得到基线分离,且不能检测到杂质10-甲酰叶酸。根据同系物HPLC色谱条件相近原则,参考《中国药典》[1]2005年版注射用亚叶酸钙冻干粉针有关物质测定色谱条件及《欧洲药典》[2]左亚叶酸钙原料药有关物质测定色谱条件,在此基础上用四点法求出容量因子对离子对试剂浓度和pH值的回归多项式,进而求得流动相离子对试剂浓度和pH值的最佳值。

    1  仪器与试剂

    1.1  仪器  Agilent1100液相色谱仪,包括Agilent 色谱工作站,单元泵,可变波长紫外检测器,外配AT-130柱温箱,TU-1800紫外可见分光光度计。

    1.2  试剂  甲醇:色谱纯。磷酸氢二钠,10%四丁基氢氧化铵水溶液,磷酸,均为分析纯。左亚叶酸钙对照品(含量99.2%,水分17%,批号20041029);亚叶酸钙消旋体(含量99.2%,水分11.7%,批号20040820);10-甲酰叶酸(《美国药典》认可标准品,含量>99.5%)。左亚叶酸钙注射液(本公司生产,批号050701,50mg/5ml)。

    2  色谱条件

    色谱柱:Varian C18 (250mm×4.6mm,5μm);流速:1.0ml/min;柱温:40℃;检测波长:286nm;进样量:20ml。

    3  四点法求出各组分峰响应面多项式

    按Schoenmakers公式组分的容量因子k’的对数和常用色谱参数(流动相中强溶剂的比例,pH值,柱温T-1等)呈一次或二次线性关系[3],对二参数即二因子体系可采用下列公式

    Lnk’=β0+β1x1+β2x2+β12x1x2,在本实验中把公式定为

    Lnk’=A+B[C]+C[pH]+D[C][pH]

    其中A、B、C、D为多项式的未定系数,[C]为离子对试剂浓度mg/ml,[pH]为流动相最终pH值,根据亚叶酸钙有关物质测定HPLC色谱条件[C]为0.8mg/ml,[pH]为8.28,取用浓度为0.1 mg/ml的左亚叶酸钙注射液水溶液用该色谱条件进行有关物质测定,色谱图见图1。(略)

    发现各杂质峰基本能得到基线分离,并能检测出10-甲酰叶酸杂质峰,设定另三个实验点为[C]:0.8mg/ml,[pH]:8.14,[C]:1.13mg/ml,[pH]:8.28,[C]:1.13mg/ml,[pH]:8.14。按k’=t-t0/t0,计算出4个实验点各组分峰的k’,代入Lnk’=A+B[C]+C[pH]+D[C][pH],求出9个峰的容量因子k’响应面多项式为:

    Lnk1’=-33.63566+27.13161[C]+4.04900[pH]-3.34589[C][pH]

    Lnk2’=-17.41685+14.07742[C]+2.08591[pH]-1.71515[C][pH]

    Lnk3’=-16.72214+13.46845[C]+1.99667[pH]-1.61905[C][pH]

    Lnk4’=-11.47669+9.01227[C]+1.36901[pH]-1.07591[C][pH]

    Lnk5’=-11.98090+8.9332[C]+1.43346[pH]-1.06335[C][pH]

    Lnk6’=-9.79820+7.70891[C]+1.17938[pH]-0.91020[C][pH]

    Lnk7’=-9.43013+6.88176[C]+1.14269[pH]-0.80801[C][pH]

    Lnk8’=-8.84756+6.48648[C]+1.08823[pH]-0.75779[C][pH]

    Lnk9’=-6.72357+4.10918[C]+0.84392[pH]-0.44892[C][pH]

    其中第五峰为最难分离物质对峰按:

    σLnk5’   σ[C]=8.9332-1.06335[pH]→0得[pH]=8.40

    σLnk5’   σ[pH]=1.4336-1.06335[C]→得[C]=1.35mg/ml

    求得色谱条件中[C]和[pH]的上限值为[C]:1.35mg/ml,[pH]:8.40。

    在[C]:1.35mg/ml,[pH]:8.28和[C]:0.8mg/ml,[pH]:8.40条件下对左亚叶酸钙注射液进行有关物质的测定,综合比较已做的四个实验点色谱图,以[C]:0.8mg/ml,[pH]:8.28和[C]:1.13mg/ml,[pH]:8.28两个实验点得出的色谱图各峰均得到较好的分离。

    色谱图见图2。

    4  方法专属性考察

    4.1  辅料的干扰性实验  按左亚叶酸钙注射液处方比例配制空白样品,用水配制成0.1mg/ml的溶液,吸取20ml进样,记录色谱图见图3-A,可见处方中的辅料对测定无干扰。

    4.2  取左亚叶酸钙标准品配制成0.1mg/ml的水溶液,进样20ml,记录色谱图见图3-B。

    4.3  氧化破坏实验  取0.1mg/ml的左亚叶酸钙注射液水溶液5ml,置10ml容量瓶内,加双氧水5ml,放置24h后进样20ml,记录色谱图见图3-C。

    4.4  酸性破坏实验  取0.1mg/ml的左亚叶酸钙注射液水溶液5ml,置10ml容量瓶内,加1mol/L盐酸5ml,放置24h,用1mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.0,进样20μl,记录色谱图见图3-D。

    4.5  碱性破坏实验  取0.1mg/ml的左亚叶酸钙注射液水溶液5ml,置10ml容量瓶内,加1mol/L氢氧化钠5ml,放置24h,用1mol/L盐酸调pH至6.0,进样20μl,记录色谱图见图3-E。

    4.6  光照破坏实验  取左亚叶酸钙注射液1支,置4500LX的强光下,放置10天,配制0.1mg/ml的水溶液,进样20μl,记录色谱图见图3-F。

    图2  [C]:1.13mg/ml[pH]:8.28所得左亚叶酸钙注射液色谱图

    Fig2  Calcuim Levofolinate Injection HPLC chromatograms of [C]:

    1.13mg/ml[pH]:8.28

    图3  方法专属性考察图谱

    Fig3  HPLC chromatograms of the exclution inspection of method

    A. 空白溶液(blank solution);   B.对照品溶液(reference solution)

    C. 氧化破坏试验(the oxidative destroyed test);D.酸破坏试验(the acid destroyed test)

    E. 碱破坏试验(the base destroyed test);F.光照破坏试验(the light destroyed test)5  线性关系考察

    称取5.03mg 10-甲酰叶酸至50ml容量瓶内,用流动相定容至刻度作为母液,分别量取母液配制成含10-甲酰叶酸0.1、0.2、0.5、1、2、4μg/ml的水溶液,分别取20μl进样,每个样品各进样3次,计算峰面积的平均值,3次峰面积的RSD均小于2%,以峰面积(A)为纵坐标,浓度(C,μg/ml)为横坐标,进行回归处理,标准曲线方程为A=28.812C-0.63894,r=0.9999。在0.1~4.0μg/ml浓度范围内线性关系良好。

    称取左亚叶酸钙标准品(含量99.2%,水分17%),用水配制成含左亚叶酸钙120、100、4、2、1、0.04μg/ml的水溶液,分别取20μl进样,每个样品各进样3次,计算峰面积的平均值,3次峰面积的RSD值均小于2%,以峰面积(A)为纵坐标,浓度(C,mg/ml)为横坐标,进行回归处理,标准曲线方程为A=79246.3C+0.058548,r=0.9999。在0.04~120μg/ml浓度范围内线性关系良好。

    6  加样回收率

    安徽省科隆药物研究所提供的有关物质测定方法中,有杂质10-甲酰叶酸的含量限制。参考《欧洲药典》左亚叶酸钙原料药有关物质测定方法和《中国药典》2005年版二部注射用亚叶酸钙有关物质测定方法,将左亚叶酸钙注射液有关物质测定方法中供试液的浓度定为0.1mg/ml。取左亚叶酸钙注射液和10-甲酰叶酸标准品配制成浓度为0.05mg/ml的供试液及0.001mg/ml的对照液,分别进样。根据供试液和对照液色谱图中10-甲酰叶酸峰的面积,用上述供试液和对照液,分别配制10-甲酰叶酸含量相对标准50%、80%、120%的供试液各3份,每份进样3次,计算得平均加样回收率n=3分别为:106.9%、110.0%、108.4%,RSD分别为1.68%、1.19%、0.46%。

    7  精密度及溶液稳定性实验

    用左亚叶酸钙注射液和10-甲酰叶酸对照品配制成浓度分别为0.1mg/ml和0.001mg/ml的溶液,连续进样6次,RSD分别为1.51%和0.43%,取上述溶液室温放置,分别于0、2、4、8、12、24h取样测定,峰面积的RSD分别为:1.10%、0.80%。表明左亚叶酸钙注射液水溶液和10-甲酰叶酸水溶液在室温下放置24h稳定性良好。

    8  日间精密度和重复性实验

    用左亚叶酸钙注射液配成0.1mg/ml的水溶液6份和0.001mg/ml10-甲酰叶酸标准品水溶液6份,分别进样20μl,有关物质总量分别为2.30%、2.30%、2.31%、2.31%、2.30%、2.30%,10-甲酰叶酸量为限度的0.64%、0.70%、0.69%、0.70%、0.67%、0.65%,RSD为0.22%、3.83%。取上述溶液分别在(1、5、10)天内由不同人员分别进样,测得10-甲酰叶酸和有关物质总量分别为0.64%、0.69%,0.65%、2.30%,2.30%、2.31%,RSD分别为4.0%、0.25%。

    9  2005年版《中国药典》和《欧洲药典》及本次实验方法差异性分析

    《欧洲药典》2005年版有左亚叶酸钙原料药有关物质的测定,无制剂的测定方法。《中国药典》2005年版只有亚叶酸钙原料、冻干粉针有关物质的测定,左亚叶酸钙原料及制剂尚未上2005年版《中国药典》。《中国药典》和《欧洲药典》对亚叶酸钙和左亚叶酸钙有关物质测定都采用溶液浓度1mg/ml,280nm的检测波长,《中国药典》采用自身对照,《欧洲药典》采用亚叶酸钙标准品作为对照而进样量则为10μl。《欧洲药典》和本次实验采用的10-甲酰叶酸对照液的浓度分别为0.005mg/ml和0.001mg/ml,限度均为小于对照液的0.8倍,《中国药典》无10-甲酰叶酸限度项。笔者根据上述条件及本人本次实验所采用的条件,分别采用280nm,286nm检测波长和左亚叶酸钙供试液浓度0.1mg/ml和1mg/ml及10μl、20μl进样量进行测定,所得结果如下。表1   不同波长、供试液和进样量所得10-甲酰 叶酸和有关物质总量 (略) 从上述结果可以看出采用左亚叶酸钙注射液供试液浓度0.1mg/ml及进样量10μl,检测波长280nm、286nm所得数据差异较小,而采用1mg/ml 20μl进样量时所得数据差异较大,这是由于1mg/ml 10-甲酰叶酸在280nm出现吸收峰,0.001mg/ml左亚叶酸钙、0.01mg/ml亚叶酸钙消旋体在286nm处出现吸收峰之故。

    10  讨论

    在确定了流动相强溶剂比例、柱温、流速等参数后,对使用离子对试剂的流动相体系,在离子对试剂浓度及pH值为未定因子时可通过对用Schoenmackers公式导出的最难分离物质对色谱峰响应面多项式求偏导数的方法,求出离子对浓度和pH值的上界限值,进而采用系统优化的方法求出最佳流动相组成。该方法可能对不具有系统优化软件的企业来说不失为一种寻找高效液相色谱最优条件的方法[4]。

    流动相离子对试剂浓度和pH值对左亚叶酸钙注射液最难分离物质对分离度的影响:从实验观察流动相离子对试剂浓度对最难分离物质对分离度的影响小于pH值对它的影响,因此在pH=8.28的条件下四丁基氢氧化铵浓度在0.8~1.13mg/ml的范围内,都能得到满意的色谱图,而在pH值8.14~8.40的范围内,以pH=8.28时得到的色谱图最优。当采用1mg/ml浓度的供试液时,左亚叶酸钙注射液各成分峰不能得到基线分离。

    采用反相离子对试剂体系测定极性化合物的有关物质时,同比例缩小离子对试剂和供试液浓度,不能得到与原配比流动相同等分离效果的色谱图,本次实验所得结果与根据《欧洲药典》左亚叶酸钙原料药色谱条件所得结果相近,且分析时色谱柱的载样量较小,有助于延长色谱柱的使用寿命。

    流动相配制时四丁基氢氧化铵水溶液以准确分析的浓度为基准配制为佳,磷酸氢二钠的取用量以带12分子结晶水的磷酸氢二钠计,应准确调节pH值至7.8,如不能做到上述几点,会使分析结果产生较大的偏差。

    本次实验所得色谱条件可作为临床前制剂研究的质量标准,企业标准和国家标准尚待各方专家进行多方面的论证和验证确定。

【参考文献】
  1 国家药典委员会.中国药典,2005年版,二部.北京:化学工业出版社,2005,186.

2 USP.01/2005 1606corrected 5.6.

3 胡昌勤.抗生素质控分析中HPLC分析的基本理论.北京:气象出版社,2006,106.

4 孙毓庆,王延琮,林乐明,等.现代色谱法及其在医药中的应用.北京:人民卫生出版社,1998,471-472.

5 付宜和,杨国庆,龚道芬,等.2,4-二硝基氟苯柱前衍生化法测定复方氨基酸注射液HPLC色谱条件的优化.药物分析杂志,2005,25(7):762-764.

6 李立荣,雷黎明,马宁,等.RP-HPLC法测定托西酸舒他西林分散片的有关物质.中国药师,2007,10(11):1105-1107.


作者单位:310050 浙江杭州,浙江省耀江药业有限公司

作者: 宋建美 2008-7-4
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