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【摘要】 测定蛇毒纤溶酶的半数致死量（LD50）并研究蛇毒纤溶酶的急性毒性。方法 小鼠单次静脉注射蛇毒纤溶酶，观察14天内的毒性反应和死亡情况并计算出LD50。结果 蛇毒纤溶酶的LD50为24783u/kg，95%可信限为21519～28823u/kg，中毒死亡时间集中在给药后48h，其毒性靶器官主要是胃、十二指肠、空肠、肺、胰。结论 蛇毒纤维蛋白溶解酶具有纤溶药相同的毒性症状，有出血倾向。
【关键词】 蛇毒纤溶酶 急性毒性 半数致死量
Study on acute toxicity of nevin fibrinolytic enzyme
ZHU Qing,YANG Wei,OU Hui-yu,et al. Guangzhou Institute of Pharmaceutical Industry, Guangzhou 510240, China
【Abstract】 Objective To measure the median lethal dose（LD50） of nevin fibrinolytic enzyme and investigate its acute toxicity in mice. Methods After single intravenous dosing, the toxicity reactions and the number of deaths of nevin fibrinolytic enzyme were observed for 14days in mice,then the LD50 was calculated.Results The LD50 of nevin fibrinolytic enzyme was 24783u/kg, and its 95% confident interval was 21519～28823u/kg.The target organs were stomach, duodenum, jejunum, lung and pancreas. The death focus on 48h after the administration.Conclusion Nevin fibrinolytic enzyme has the same toxicity as the other fibrinolytic enzymes, which has bleeding tendency．
【Key words】 nevin fibrinolytic enzyme; acute toxicity; LD50
蛇毒中含多种具有生物活性的酶、多肽和蛋白质, 其特殊的功能已在科学研究和医疗实践中获得了广泛应用。 利用蛋白质分离技术从蛇毒中高度纯化而得的蛇毒纤溶酶可直接溶解纤维蛋白凝块，可用于心脑血栓和心肌梗死的治疗。近年来未见对蛇毒纤溶酶毒性的研究报道，为此本文对蛇毒纤溶酶急性毒性进行了初步研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物 NIH小鼠，SPF级，50只，雌雄各半，购自广东省医学实验动物中心［实验动物合格证号：0026628，实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2003-0002，实验动物监测证号：粤监证字2007A004］。
1.1.2 试剂和药物 蛇毒纤溶酶（批号：070274，北京博康宁生物医药科技有限公司）；0.9％氯化钠注射液（批号：060626-07，昆明市宇斯药业有限责任公司）；甲醛溶液（批号：20061101-11，广州化学试剂厂）。
1.1.3 仪器 全密封自动脱水机（ASP 300，德国Leica公司）；平推式切片机（Microm MH400，德国Leica公司）；生物组织包埋机（Leica EG 1164，德国Leica公司）； 病理图像分析系统 （广州亿鸣公司）。
1.2 方法［1,2］ 选用检疫合格的NIH小鼠50只，将动物按体重、性别随机分为5组，每组10只动物（雌雄各半），根据预试结果给药剂量设定为38000、30400、24320、19456、15565u/kg，给药容积为0.2ml/10g。给药后连续观察4h，如无异常则终止持续观察，改为每天观察1次，观察至给药后第14天，观察内容包括：动物外观体征、行为活动、腺体分泌、呼吸、粪便、给药局部、动物死亡数量、死亡时间、濒死前反应等。每组动物分别于给药前及给药后1、2、3、7、14天称体重6次。实验过程中因濒死而处死的动物、死亡的动物以及实验结束时仍存活的动物均进行大体解剖，肉眼观察主要脏器变化，若有异常均应记录并进行组织病理学检查。饲养室温度与湿度：20～26℃，40%～70%。
1.3 统计学分析 实验数据采用平均值±标准差（x±s）表示，两组间均数比较用t检验，按Bliss法计算LD50及95%可信限。
2 结果
2.1 给药后毒性反应症状及LD50值 38000u/kg剂量组动物给药后即刻出现少动、呼吸急促的现象，然后趴卧不动，约30min后有6只小鼠死亡，1只小鼠在给药后约1h死亡，3只小鼠在给药后约3h死亡，该剂量组动物死亡前主要反应为阵挛性抽搐、全身震颤、角弓反张、翻正反射消失，其中有2只动物鼻腔出血。30400u/kg剂量组动物给药后即刻亦出现少动、呼吸急促的现象，有4只动物在给药6h内死亡，动物死亡前主要反应为阵挛性抽搐、全身震颤以及腹式呼吸。本组2只动物在给药后第2日死亡。24320、19456、15565u/kg剂量组动物给药后即刻出现少动、呼吸急促的现象，大部分动物约10min后恢复正常，动物死亡发生在药后48h内。从药后第3天到药后第14天，幸存动物活动状况良好，无异常表现。各组动物死亡时间分布情况见表1。用Bliss法计算蛇毒纤维蛋白溶解酶单次静脉注射给药NIH小鼠的LD50为24783u/kg，95%可信限为21519～28823u/kg，见表2。表1 NIH小鼠单次静脉注射蛇毒纤维蛋白溶解酶后死亡情况分布表表2 NIH小鼠单次静脉注射蛇毒纤维蛋白溶解酶的LD50测定（Bliss法）
2.2 体重变化 静脉注射给药后第1天除15565u/kg剂量组动物体重维持在给药前水平外，其余各剂量组动物均出现体重下降现象。从给药后第2天开始，各剂量组幸存动物体重逐渐增长，且体重增加幅度相近，见表3。表3 NIH小鼠单次静脉注射蛇毒纤维蛋白溶解酶后体重变化情况
2.3 病理组织学检查结果 蛇毒纤维蛋白溶解酶各剂量组给药后死亡和濒死的动物剖检发现胃近幽门部、肠系膜、十二指肠、空肠、肺、胰均有出血和充血的现象，对这些异常的组织脏器进行组织病理学检查可见：肺脏间质均出现弥漫性大量红细胞，支气管周围间质更为严重，有的还可见溶解的红细胞，为急性肺出血。胰腺出现不同程度的出血，胰腺小叶间质较宽，并可见有数量不等的红细胞，有的还可见溶解的红细胞。胃出现不同程度出血，胃黏膜层、黏膜下层可见数量不等的红细胞。十二指肠出现不同程度出血，十二指肠黏膜固有层、黏膜下层可见数量不等红细胞，部分动物十二指肠黏膜固有层出现轻度水肿。回肠出现轻度出血，回肠黏膜固有层、黏膜下层可见少量红细胞，部分动物回肠黏膜固有层出现轻度水肿。给药后第14对存活的动物进行大体解剖，各剂量组动物胰腺、十二指肠、空肠及肠系膜、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、脑等主要脏器均未发现有异常改变。
3 讨论
凝血中形成的纤维蛋白，可经纤溶酶作用从精氨酸-赖氨酸键上分解成可溶性产物，使血栓溶解。纤维蛋白溶解药激活纤溶酶而促进纤溶，也称溶栓药。其严重不良反应为出血倾向，以注射或穿刺局部血肿最为常见，其次为组织内出血。因为被激活的纤溶酶不但溶解病理性纤维蛋白，也溶解生理性的纤维蛋白［3］。
在本实验条件下，蛇毒纤维蛋白溶解酶单次静脉注射的毒性症状与其他纤溶药相同，有出血倾向，其毒性靶器官主要是胃、十二指肠、空肠、肺、胰，本药未发现其他特异的症状。蛇毒纤维蛋白溶解酶毒性反应集中在给药后24h，中毒死亡时间集中在给药后48h。NIH小鼠尾静脉单次给药的LD50为24783u/kg，95%可信限为21519～28823u/kg。
【参考文献】
1 化学药物急性毒性试验技术指导原则课题研究组．化学药物急性毒性试验技术指导原则,2005,3.
2 袁伯俊，王治乔．新药临床前安全性评价与实践．北京：军事医学科学出版社，1997，27-28.
3 杨藻宸.药理学和药物治疗学.北京：人民卫生出版社,2000， 1009-1011.
作者单位：510240 广东广州,广州市医药工业研究所