SNP芯片技术进展

【摘要】  SNP具有数量多、分布广、易于快速检测、便于分型等特点，其分析检测技术的发展也引起了众多研究人员的重视，不断有新的检测方法出现。RFLP技术、SBE技术、TaqMan技术、L-RCA技术等为SNP的检测提供了快捷准确的方法。由于SNP之间的关联紧密复杂，因此需要一种有效的检测方法，芯片检测作为一种低成本、高通量的检测方法已成为大规模SNP分析的有力检测工具，将来可为遗传学研究分析、个体化医疗的实施提供强有力的技术保障。

【关键词】  单核苷酸多态性；芯片；分型；个体化医疗

【Abstract】  SNP is widely distributed in the human genome and it attracts the interest of many scientists. It can be detected much easier and faster. Several detection methods have been developed with high sensitivity in last years such as RFLP technology, single base extension method, TaqMan technology and L-RCA technology. Because of complicated relationship between SNP, it needs an effective detection. As an inexpensive and high throughput approach, microarray can give a guidance for personalized medicine in clinical and apply a diagnosis instrument for personalized treatment in the future.

    【Key words】  polymorphism of mononucleotide; array; personalized treatment

    单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）是指存在于基因组特定位置上的单个核苷酸的变异，即由单个核苷酸置换、颠换、插入或缺失所形成的遗传变异现象。在人类基因组中，已发现的SNP数量超过1000万，其分布密度在100～1000bp不等。SNP作为第三代遗传诊断标记，在疾病基因组学，药物基因组学和群体进化等理论研究中具有重大意义。SNP可直接影响个体间对疾病的易感性、外源物质的代谢差异和药物不良反应表现，因此对SNP的研究在个体化用药、个体化治疗中具有重要的指导作用。大规模SNP分型则需要准确可靠的检测方法作为技术支持，而SNP芯片技术的研究与发展日后可成为分子诊断、临床检验、临床治疗、新药开发等方面的重要研究手段［1〗

    1  SNP的检测方法与技术

    传统SNP检测方法包括DNA测序、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymor phism，RFLP）、单链构象多态性和变性梯度凝胶电泳等。这些技术必须通过凝胶电泳进行检测，不易实现自动化，且不能进行多重分析，难以大规模开展分析工作。新兴的方法包括TaqMan探针技术、基因芯片技术等。其中基因芯片技术具有高通量、简便快捷、平行化和成本低廉等优点，且芯片技术的高密度探针矩阵可为大规模SNP分型提供一个高效检测途径。芯片技术平台包括微球微点阵，纤维薄膜微点、玻璃片基微点阵芯片等，其探针密度跨越范围几百至上百万不等，其中GoldenGateTM［2〗所使用的微球芯片密度可达100万，Affymetrix SNP芯片［3〗密度近200万，可见芯片技术的探针密度可无限扩增。而高通量的大规模SNPs筛选其瓶颈之处取决于DNA的制备方法与制备技术，而非杂交平台的选择。

    2  SNP芯片技术

    2.1  等位基因特异性延伸（allele-specific primer extension，ASPE）  此外Liu等人［4］在对中国人CYP3A基因多态性检测实验即采用了该设计方法完成了中国人CYP3A基因的多态性分型工作（这段增加点内容，RFLP不属SNP芯片，在芯片上做延伸标记，操作难，文献A genome-wide scalable SNP genotyping assay using microarray technology）。

    2.2  单碱基延伸（single base extension，SBE）技术  单碱基延伸技术是目前低密度芯片研发及制备DNA的主要技术。主要通过设计带有双重功能的SBE引物序列，该引物3’端为目的基因的互补序列，退火后在链3’端即SNP位点处延伸上带有荧光信号标记的单个碱基，5’端为与探针互补的标签序列。在目的基因指数扩增步骤之后，单碱基延伸技术进一步线性放大荧光信号并提高检测灵敏度。该法可对随机选取的SNP位点进行准确特异的多重水平筛选［5,6〗。Hirschhorn等［7〗选取100多个SNP位点利用SBE方法进行基因分型鉴别，其准确度高达99%。类似反应原理研制的SNP stream技术以PCR产物为模板，384孔板内完成单碱基延伸标记，其多重扩增规模达12重［8〗。但是由于只加入2种不同类型荧光及一种等位基因延伸引物使得SNP stream每管反应只能检测1种突变类型，大大降低了SNP的突变类型选择，限制了其在临床上的应用［9〗。另外一种单碱基延伸技术是根据SNP突变类型设计2条SBE引物序列，3’末端碱基为SNP位点，延伸的碱基为SNP下游碱基［10〗。根据匹配程度完成延伸标记反应并检测等位基因具体类型。双SBE引物的设计对比于SNP stream技术来说只需要一种荧光类型，不存在限制SNPs突变类型检测的问题。

    2.3  TagMan探针及芯片  TagMan探针是定量检测靶DNA的一种方法，5’末端携有荧光标记物，3’端标有荧光淬灭集团，利用Tag聚合酶的外切活性，并伴随荧光共振能量转移恢复染料的荧光活性，碱基序列间的不完全匹配则导致所释放荧光强度的差异进而用来鉴别基因多态性差异。将实时检测与芯片技术融合的TagMan芯片，其探针3’端经氨基修饰后依靠共价键结合于芯片表面，探针中间序列携带荧光集团，依赖碱基序列间的物理距离而使中间序列的荧光集团完成靶DNA遗传信息的实时分析工作［11〗。TagMan芯片既融合了常规TagMan技术定量检测，灵敏度及实时检测功能，也兼备芯片的平行化高通量分析这一特点。由于PCR扩增与TagMan探针酶切同步进行，随着多重水平的增加，必然导致非特异性信号增多，该技术是否适用于中低密度的SNP芯片，尚有待于进一步研究。

    2.4  基于连接的滚环扩增技术（ligation-rolling circle ampification，L-RCA）  T4连接酶或热稳定连接酶介导的挂锁探针环化方法可灵敏及特异的鉴别靶DNA序列的点突变。L-RCA技术挂锁探针的5’及3’端序列同靶DNA的SNP位点上游及下游序列分别互补，3’端延伸一个碱基后，连接酶作用下可成环状结构。探针序列中间携有通用序列、标签序列及酶切位点［12〗。环状探针序列经滚环扩增后再做酶切处理即可做杂交判别。Baner等［13〗采用该技术检测干豆状核变性病人的13个SNP位点突变同疾病相关性试验中，设计13条探针检测位点突变类型。 L-RCA的设计及基因序列的复杂程度等导致通量不高，不能满足高通量的芯片分型需要。

    2.5  分子倒置探针  分子倒置探针（Molecular Inversion Probe，MIP）同线性探针序列相比能够指数级减少由于线性引物序列所引起的交叉反应及二聚体现象，具备了分子挂锁探针的优点。MIP探针序列由7部分序列组成：2个内切酶识别位点，可利用限制性内切酶（HindⅢ，BamHⅠ，EcoRⅠ，EcoRV，XbaⅠ）处理探针序列，2段目的基因互补序列（填补SNP位点两端序列并控制序列特异性）、2段通用引物序列以及1段特异性标签序列。探针序列同目的基因组结合后成环状，MIP探针3’端获得一个碱基并延伸后在连接酶作用下与5’序列连接成环，该延伸位点即为SNP检测位点。由于内切酶I的作用而发生序列倒置重组。通用引物作用下完成信号扩增，内切酶Ⅰ处理后获得Taq标签序列。该反应在同一体系中可完成1万多重的SNP检测通量［14〗岩杂τ糜赟NP定制。另一方面，尽管标签（tag）SNP较少，数量众多的SNP可在一定程度上弥补此不足。

    2.7  基于连接ASPE技术  GoldenGateTM技术是目前定制SNP芯片技术中通量最高的，可达100万，但对基因组需要量只需要250ng。其原理是每个SNP设计2条等位基因特异性引物（ASO）和1条位点特异性引物 （LSO），均携有不同的通用引物序列。LSO位于SNP下游10～20bp处，从而能够有效避开重复序列以及回文序列，保证了反应特异性。利用聚合酶填补ASO及LSO间空隙，并由连接酶封闭缺口。以所得产物为模板，3条通用引物（其中2条与ASO互补的通用引物标记有不同的荧光素）即完成扩增及杂交反应。该技术的多重检测水平可极大的满足基因分型的检测需要，基因分型准确率可达96.64％。但是该技术只适用于二态变化的SNP检测，所能检测的SNP大约只有60%［2,15〗。对于全基因组扫描，该技术的芯片产品所检测的是标签SNP，遗传信息含量丰富。此外，Macgregor等研究显示，在应用DNA Pool进行全基因组关联研究， GoldenGateTM比Affymetrix SNP芯片更为有效（Highly cost-efficient genome-wide association studies using DNA pools and dense SNP arrays. Stuart Macgregor1,*, Zhen Zhen Zhao2, Anjali Henders2, Martin G. Nicholas1, Grant W. Montgomery2 and Peter M. Visscher1）。

    3  前景与展望

    随着芯片技术的发展，对于原核生物等类似简单的基因组序列，其基因组DNA可以直接应用芯片技术进行多态性检测。面对高度复杂的人类基因组，从约30亿碱基对中鉴别分型单个碱基的变化无疑是一件浩瀚的工程。针对大规模基因组内遗传学SNPs的筛查以及小规模的个体药物检测与临床应用检测芯片的需求，现有SNP芯片技术的瓶颈依旧是基因组的处理与制备。随着基因体外扩增技术与信号级联放大技术的发展，虽解决了有限的样本基因组问题，但是由于扩增反应在设计上的束缚以及反应复杂性等因素，现存的主要问题是如何完全及高效地获得个体SNPs信息。这也是将来芯片技术所需解决的一个问题。

    SNP芯片的开发及在基因多态性研究上不但提高了个体化医疗检测技术的水平，也为日后个体化药物的使用提供诊断依据，促进小规模诊断市场的开发与完善。SNP芯片的研究有能力成为个体化医疗的技术保障，随着SNP芯片检测技术的发展，针对药物代谢基因所研制的中低密度遗型传学检测芯片，其低成本、高通量、平行化的检测特点适应了个体化用药检测的需求，将来可在个体药代研究、个体化医疗以及个体用药指导等各方面的医疗检验中得到广泛应用［16〗。

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作者单位：上海，生物芯片上海国家工程研究中心 吉林长春，吉林农业大学