大肠埃希菌耐药相关Ⅰ类整合子的种内传播的研究

【摘要】  目的 了解大肠埃希菌Ⅰ类整合子以及多重耐药性在菌种内水平传播的能力，并对Ⅰ类整合子进行初步基因定位。方法 PCR法扩增Ⅰ类整合子并测序；用携带有Ⅰ类整合子的大肠埃希菌进行质粒结合试验筛选接合子，并对接合子进行抗生素敏感性试验，PCR扩增Ⅰ类整合子，并测序；对未得到接合子的埃希菌进行斑点杂交试验初步确定整合子的基因定位。结果 200份大肠埃希菌共检出53株Ⅰ类整合子阳性样本；53株携带有Ⅰ类整合子的大肠埃希菌进行结合试验共得到27株接合子，说明有57.4％（27/47）的Ⅰ类整合子位于接合性质粒上，42.6%（20/47）位于染色体或其他非接合性质粒中。药物敏感试验结果提示，部分（20株）结合子抗性发生完全传递，另有7株结合子表现出与供体菌不同的耐药表型。PCR结果显示27株接合子出现和供体菌长度一致的整合子，测序结果显示与供体菌的同源性为100％。对26株未得到接合子的埃希菌进行斑点杂交试验显示，19株菌Ⅰ类整合子位于质粒DNA上，4株菌位于染色体DNA上。1株（134＃）染色体DNA，质粒DNA斑点杂交试验均为阳性，该菌含有1000bp和3100bp两个Ⅰ类整合子。结论 健康人群肠道大肠埃希菌Ⅰ类整合子的携带率为26.5%；Ⅰ类整合子可位于质粒或染色体上，但大部分位于质粒上。Ⅰ类整合子可在同种细菌间水平传播，耐药性也发生相应转移，这是造成细菌多重耐药性迅速播散的主要原因。

【关键词】  大肠埃希菌；耐药性；Ⅰ类整合子；基因盒；结合试验；斑点杂交

The level transport of class I integron in Escherichia coli strain isolates

    LI Ting, LU Lan, YANG Ling-feng, et al.Center for Disease Prevention and Control of Pudong District, Shanghai 200135,China

    【Abstract】  Objective  To investigate the level transport of class I integron and multi-drug resistance and dissemination of antibiotic resistance in Escherichia coli strain isolates.Methods  The presence of class 1 integron was examined by PCR and then the horizontal transfer characteristic of class I integrons among E. coli was tested by plasmid conjugation experiments. The antibiotics susceptibility of the 17 antibiotics was tested with the disk diffusion method. The presence of class 1 integrons was examined by PCR. The integron content was purified to DNA sequencing. Genetic mapping located the integrons by dot bolt hybridization.Results  We got 53 class 1 integron positive isolates from all the 200 E. coli isolate. 57.4% （27/47） transconjugants were collected, which proved that 54.7% of class I integron was （27/17） located on conjugative plasmid, followed by some of transferred resistance patterns. 42.6% （20/47） was located on chromosome DNA or nonconjugative plasmid DNA. PCR amplifiers of the class I intgron resulted the same length and the same sequence with the givener. By dot blot hybridization, 4 isolates integrons on chromosome DNA and 19 on nonconjugative plasmid, and we also got 1 one iosolats both on chromosome DNA and nonconjugative plasmid, which carried a 1000bp and a 3100bp class I integron.Conclusion  Class 1 integron is detected in 26.5% of the isolates. Class I integrons can reside lonely in the plasmid or chromosome, it also can reside in the plasmid and chromosome at the same time. Class I integrons can be transferred horizontally among different strains, it may be the cause of horizontal spread of resistance gene. It implies the necessary to control the use of antibiotics and prevent the transference of antibiotic resistance and antibiotic resistanceintegron among people.

    【Key words】  Escherichia coli; antibiotic resistance；class one integrons; box gene; plasmid conjugation; dot bolt hybridization

    由于抗生素长期、持续和广泛的不合理和过度使用，细菌已经产生了强大的耐药性甚至多重耐药性。过去人们对细菌产生耐药性机制的研究主要集中于细菌染色体基因发生突变，认为主要是基因突变的积累导致细菌产生耐药性，近年来人们发现主要是由于耐药基因的水平传播而导致耐药性在同种细菌或不同种细菌之间迅速蔓延。能发生水平传播的耐药基因主要位于转座子或质粒等可移动的元件上。1991年Hall和Collis首次提出了整合子的概念，将整合子定义为包含能够识别和捕获可移动的基因元件的位点特异性重组系统。细菌通过整合子在整合酶的作用下，捕获外来基因，并使其表达。整合子分为耐药整合子和超级整合子［1］。目前已知耐药相关整合子有3类，其中Ⅰ类整合子主要存在于革兰阴性肠杆菌中，在细菌传播耐药性方面的作用最为显著。大肠埃希菌是一种重要的条件致病菌，并且它广泛分布于外环境和人的肠道，可能成为耐药基因的巨大的天然储存库，在细菌耐药性传播方面有重要意义。本研究拟调查健康人群肠道大肠埃希菌耐药相关Ⅰ类整合子的携带和情况以及种内传播的能力，并对整合子进行初步的基因定位。

　　1  材料与方法

    1.1  菌株  大肠埃希菌，来源于健康人肠道，由上海市浦东新区疾病预防控制中心保存。

    1.2  PCR扩增  其Ⅰ类整合子5’CS～3’CS之间的可变区，引物为5’CS: GGCATCCAAGCAGCAAG，3’CS: AAGCAGACTTGACCTGA。DNA聚合酶为Blend TAQ（2.5u/μl,TOYOBO）。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，GOLDVIEW 染色，TANON凝胶成像系统下分析结果。测序工作由上海生工生物技术有限公司完成。测序结果经Blastn检索GenBank 数据库（www.ncbi.nlm.nih.gov），获得同源信息。

    1.3  接合子的筛选  受体菌为E.Coli C600［购自中国普通微生物菌种保藏管理中心,生化特征：不发酵乳糖，不含质粒，对萘啶酸（NAL）、利福平（RIF）耐受］。取100μl菌液均匀涂布于三种含双抗的中国蓝平板［利福平（AMRESCO）100μg/ml＋氨苄西林（AMRESCO）100μg/ml］、［利福平（BBI）100μg/ml＋四环素（AMRESCO）25μg/ml］、（利福平100μg/ml＋链霉素25μg/ml），37℃培养18h筛选接合子。供体菌分别接种含氨苄西林100μg/ml、四环素25μg/ml、链霉素25μg/ml的中国蓝平板；受体菌接种含利福平100μg/ml的中国蓝平板；再将供、受体菌分别接种筛选接合子的含双抗中国蓝平板进行对照试验，37℃培养18h。选择菌落较小，不透明的红色菌落，接种营养琼脂平板再次分纯培养，挑取接合子菌落，-30℃保存于含有30％甘油的TBS中。

    1.4  供体菌与接合子的药物敏感试验  药敏试验采用纸片扩散法（E-B）法，药敏结果判断参照NCCLS（2006）标准。同时使用标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922，金黄色葡萄球菌ATCC25923，铜绿假单胞菌ATCC27853作为质量控制。所采用的药敏纸片包括：氨苄西林AMP（10μg/片），头孢唑啉CZ（30μg/片），头孢噻肟CTX（30μg/片），头孢呋新CXM（30μg/片）， 氯霉素C（30μg/片）， 红霉素E（15μg/片）， 链霉素STR（10μg/片），亚胺培南（300μg/片），丁胺卡那霉素AN（30μg/片），呋喃妥因（300μg/片），氟哌酸NOR（10μg/片），四环素TET（30μg/片），复方新诺明SXT（1.25μg/片），妥布霉素To（10μg/片），甲氧葡胺嘧啶T（5μg/片），头孢美唑CMZ（30μg/片），庆大霉素GM（10μg/片），均购自OXID。

    1.5  接合子的Ⅰ类整合子PCR扩增并测序  对接合子进行Ⅰ类整合子PCR扩增方法同上。测序工作由上海生工生物技术有限公司完成。

    1.6  斑点杂交  提取未得到接合子的大肠埃希菌的质粒和染色体DNA［MiniBEST Bacterial DNA Extraetion Kit（Takara）］，100℃加热变性。将变性后的DNA点在Hybond-N+尼龙膜（AP.PNR303B），固定。将固定好的尼龙膜和制备好的I类整合酶探针（Roche公司地高辛探针标记试剂盒）及杂交液放入杂交管中，进行预杂交和杂交，暗室中显色，拍照。

　　2  结果

    2.1  整合子检测  有53株（26.5%）大肠埃希菌检出Ⅰ类整合子，共获得7条不同大小的片段，构成10种不同的电泳图谱。表1  大肠埃希菌中Ⅰ类整合子的检测

    2.2  结合子的筛选  53株Ⅰ类整合子阳性的大肠埃希菌中有6株因对利福平耐药无法筛选。其余47株共得到27株接合子，阳性率为57.4％（27/47）。有20株［42.6%（20/47）］未得到结合子。

    2.3  接合子的抗生素敏感试验结果  27株接合子抗生素敏感试验，20株菌的抗性发生完全传递，接合子的耐药谱和供体菌一致。2株菌（菌株8,14）接合试验前后抗生素敏感性未发生变化，有5株接合子耐药谱和供体菌有所不同。供体菌23对氯霉素敏感，而接合子对氯霉素耐药，供体菌139对甲氧葡胺嘧啶、复方新诺明、阿莫西林、头孢唑啉、头孢噻肟、链霉素、氟哌酸耐药，受体菌仅对四环素、红霉素、甲氧葡胺嘧啶、复方新诺明、阿莫西林、链霉素、氟哌酸耐药，对头孢唑啉、头孢噻肟的耐药性消失。接合子141仅传递了对甲氧葡胺嘧啶、链霉素、氯霉素、复方磺胺的耐药性，对阿莫西林、头孢唑啉、头孢噻肟、呋喃妥因、妥布霉素、庆大霉素、丁胺卡那霉素、氟哌酸的耐药性消失，接合子166对庆大霉素的耐药，对其他抗生素如甲氧葡胺嘧啶、复方磺胺、妥布霉素敏感。接合子179仅传递了对甲氧葡胺嘧啶的耐药性，其他耐药性如复方磺胺、阿莫西林、呋喃妥因、氟哌酸、妥布霉素、庆大霉素的耐药性丢失，却产生对链霉素的耐药性。 见表2。表2  供体菌及其接合子的药敏谱

    2.4  接合子Ⅰ类整合子PCR扩增及测序结果  接合子的Ⅰ类整合子PCR扩增结果发现，27株接合子全部出现扩增条带，PCR扩增阳性的条带长度和供体菌一致（见图1）。测序结果经Blastn检索，与供体菌同源性为100%（见表3）。 表3  接合子Ⅰ类整合子所携带的基因盒

    2.5  斑点杂交试验结果  提取Ⅰ类整合子扩增结果阳性但未得到结合子的26株埃希菌的质粒和染色体DNA进行斑点杂交试验，结果显示，15株菌Ⅰ类整合子位于质粒DNA上，2株（32，196）未提取到质粒DNA的埃希菌染色体DNA为阳性。2株（62＃， 174＃）质粒DNA中未扩增到Ⅰ类整合子的埃希菌染色体DNA斑点杂交试验结果阳性。1株（134＃）染色体DNA，质粒DNA斑点杂交试验均为阳性，该菌含有1000bp和3100bp两个Ⅰ类整合子。

    3  讨论

　　耐药基因通过水平传播使耐药性在细菌中迅速扩散，当耐药基因成为整合子的一部分时，其扩散速度增加，机制如下：（1）单个基因盒通过整合子编码的整合酶移动；（2）当整合子含有基因盒重组位点时（可能通过目标转移位）时的移动；（3）包含整合子的较大转移子如Tn21的移动；（4）含有整合子的结合质粒在异种细菌间的移动［1］。但是，也有人认为整合子结构非常稳定，因此，获得耐药性的主要方式可能是通过获得一个携带有耐药基因的新的整合子，而并非通过原有整合子获得新的耐药基因［2］。整合子的移动借助转化、转导、接合，其中接合是最为常见的形式，通过耐药菌与敏感菌菌体的直接接触，由耐药菌将耐药因子转移给敏感菌，可在菌种之间，也可跨越菌种的界限，在细菌和真菌之间传播［3］。接合主要出现在革兰阴性菌，特别是在肠道菌中。根据质粒是否能通过接合作用传递，分为接合性质粒和非接合性质粒。接合性质粒（如F质粒和R质粒）带有与传递有关的遗传物质，非接合性质粒在一定条件下通过共存的接合性质粒的诱导或转导而转移。本研究发现有57.4％（27/47）的Ⅰ类整合子位于接合性质粒上，42.6%（20/47）位于染色体或其他非接合性质粒中。对20株位于染色体或其他非接合性质粒中进一步进行的斑点杂交试验显示，其中15株菌位于质粒DNA上，4株位于染色体DNA上。1株（134＃）染色体DNA，质粒DNA均发现Ⅰ类整合子存在，该菌含有1000bp和3100bp两个Ⅰ类整合子。药物敏感试验结果提示，部分（20株）结合子抗性发生完全传递，还有部分（7株）结合子表现出与供体菌不同的耐药表型。2株菌（菌株8,14）接合试验前后抗生素敏感性未发生变化，3株（139,141,166）接合子耐药表型仅部分传递。另有1株（23）供体菌对氯霉素敏感，而接合子对氯霉素耐药，1株（179）接合子仅传递了对甲氧葡胺嘧啶、复方磺胺的耐药性，其他耐药性如阿莫西林、呋喃妥因、氟哌酸、妥布霉素、庆大霉素的耐药性丢失，却产生对链霉素的耐药性。整合子中耐药基因的表达受到多种因素的影响：基因盒位于整合子中的位置（也就是顺序）；启动子的强弱；attC基因的不完全的反向重复序列可能形成主干环形结构，造成下游基因完全沉默；附加的信号，如位于氯霉素耐药基因盒的翻译减弱信号也可以控制翻译情况，当然，这仅仅是个特例［4］。另外，宿主菌内环境及染色体对耐药基因表达起着重要作用，细菌间的基因传递可使某些“沉默基因”得以表达［5］。因此，细菌耐药性的表达是一个非常复杂的过程。受到耐药基因的基因结构以及耐药基因与宿主细胞间的相互作用等诸多方面的影响［6］。本研究通过接合子的Ⅰ类整合子PCR扩增结果发现，27株接合子全部出现与供体菌长度一致的扩增条带，测序结果也完全相同，提示Ⅰ类整合子发生完全转移。一些学者［2，6，7］认为整合子是一个稳定的结构，它以完整的结构在细菌间进行传递要比单个基因盒移动或被整合酶整合更为频繁。本研究结果支持这个观点，但还需要进一步深入研究。有20株埃希菌的Ⅰ类整合子由于位于非接合性质粒上，因此在本试验中未发生传递。但是，整合子可通过其他方式发生转移，如通过位于染色体或大质粒上的转座子等［2，4］。本研究证实Ⅰ类整合子可在大肠埃希菌种内传递，使敏感细菌产生耐药性。因此，严格控制抗生素的使用迫在眉睫。从基因水平上控制细菌耐药基因的传播和表达，也是学者们研究的一个新思路。

【参考文献】
  1 AC Fluit,FJ Schmitz. Resistance integrons and super-integrons.Clinical Microbiology and Infection,2006，10 （4）:272-288.

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4 Sang Gyun Kang, Deog Yong Lee, Sung Jae Shin, et al. Changes in patterns of antimicrobial susceptibility and class 1 integron carriage among Escherichia coli isolates. J Vet Sci,2005,6（3）:201-205.

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6 Mazel D. Integrons: agents of bacterial evolution. Nat Rev Microbiol,2006,4:608-620.

7 Gillings M, M Holley, H Stokes,et al.Integrons in Xanthomonas: a sou+rce of species genome diversity. Proc Natl Acad Sci USA,2005,102:4419-4424.

作者单位：200135 上海，上海市浦东新区疾病预防控制中心检验检测部微生物检验科