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【摘要】 目的 观察胰岛素替代治疗对1型糖尿病脑病海马齿状回颗粒下区（SGZ）神经干细胞增殖和空间学习记忆的影响。方法 将健康成年雄性Wistar大鼠随机分为糖尿病脑病组、生理盐水治疗组、胰岛素治疗组及正常对照组，各组大鼠均为10只。在用链脲佐菌素建立1型糖尿病脑病模型后的第5天，分别用胰岛素和生理盐水替代治疗55天，再通过Morris水迷宫测试及5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU，一种神经干细胞DNA合成的标记物）免疫组织化学方法，分别观察和比较各组大鼠SGZ神经干细胞增殖和空间学习记忆的动态变化。结果 糖尿病脑病组大鼠和生理盐水治疗组大鼠SGZ神经干细胞（BrdU阳性细胞）数或者逃避潜伏期和游泳轨迹距离均呈明显下降或者升高的趋势（P＜0.01），用胰岛素替代治疗后，以上三个指标均被明显逆转至接近正常水平（P＜0.01）。结论 1型糖尿病个体内长期缺乏胰岛素可对SGZ神经干细胞增殖和学习记忆产生负性影响，这可能是引起1型糖尿病脑病发生的一个因素，故尽早用胰岛素进行干预具有原发病因治疗和防治其继发性脑病的双重作用。
【关键词】 1型糖尿病脑病；胰岛素替代治疗；神经干细胞；细胞增殖；学习记忆；齿状回；海马；大鼠
Effects of insulin replacement therapy on the proliferation of neural stem cells in hippocampal dentate gyrus and spatial learning and memory of streptozotocin-induced type 1 diabetic encephalopathy rats
CUI Wei-gang, GUO Ling, LAN Ling, et al.Department of Anatomy, Guangxi Medical University, Nanning 530021，China
【Abstract】 Objective To investigate the effects of insulin replacement therapy on proliferation of dentate gyrus neural stem cells as well as spatial learning and memory of streptozotocin-induced type 1 diabetic encephalopathy rats.Methods Adult male Wistar rats were randomly and equally divided into four groups: type 1 diabetic encephalopathy, saline therapy, insulin therapy and intact groups. After the type 1 diabetic encephalopathy rat models were set by streptozotocin for 5 days, insulin and saline were used respectively to treat the related model rats for 55 consecutive days. Morris water maze and bromodeoxyuridine immunohistochemistry were used to detect the changes in spatial memory and learning, and the neural stem cell proliferation in the subgranular zone （SGZ） of hippocampal dentate gyrus of each rat group.Results Both the number of BrdU-immunoreactive （BrdU-IR） cells and the abilities of spatial learning and memory in the rats with diabetic encephalopathy, and in the rats of saline solution therapy were significantly reduced （P<0.01）, while insulin replacement therapy reversed the above parameters to the normal levels （P<0.01）.Conclusion Long-termed lack of insulin in type 1 diabetes may put a negative effect on the proliferation of neural stem cells in SGZ and on the spatial learning and memory, which in turn results in development of diabetic encephalopathy. The above data indicate that insulin replacement therapy exertsdouble effects on treating primary type 1 diabetes and on preventing and treating the related secondary complication of diabetic encephalopathy.
【Key words】 type 1 diabetic encephalopathy; insulin substitute therapy; neural stem cells; cell proliferation; learning and memory; dentate gyrus; hippocampus; rat
长期研究表明，因胰岛β细胞功能失常而导致个体内长期缺乏胰岛素的1型糖尿病可引起糖尿病脑病（diabetic encephalopathy），该脑病的临床表现为脑结构异常和认知功能障碍，但其发生机制却十分复杂［1，2］。由于哺乳动物海马齿状回颗粒下区（subgranular zone, SGZ）不仅终生存在着神经干细胞，而且与学习记忆密切相关［3］，故研究者开始从SGZ神经干细胞着手，研究该脑病的发生原因。然而在这个研究领域中，有的单独探索神经干细胞的生物学行为变化［4］；有的则单独观察学习记忆能力的改变［5］。若将上述两个方面整合起来进行研究，便有可能获得较为系统的资料。为此，我们已在建立1型糖尿病模型大鼠的基础上，将SGZ神经干细胞增殖与学习记忆两者结合起来进行了针对性研究，并证实了在胰岛素合成或分泌障碍的长期异常状态下，SGZ神经干细胞增殖程度与空间学习记忆能力呈现出相互平行的明显下降趋势（另文发表）。为进一步研究胰岛素、SGZ神经干细胞增殖、学习记忆三者之间的内在联系，本研究也通过建立1型糖病脑病和胰岛素替代治疗的大鼠模型，利用Morris水迷宫和5-溴脱氧尿嘧啶（BrdU）免疫组化方法，观察胰岛素替代治疗后SGZ神经干细胞增殖和空间学习记忆的动态变化，为阐明1型糖尿病脑病的发生机制及其防治提供资料。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 小鼠抗大鼠5-溴脱氧核苷尿嘧啶（bromodeoxyuridine, BrdU）单克隆抗体、生物素结合IgG、链菌素抗生物素过氧化物酶、链脲佐菌素（Streptozotocin）、BrdU，均为美国Sigma公司产品；鱼精蛋白锌长效胰岛素为江西万邦制药厂产品。
1.2 动物分组 将40只成年雄性Wistar大鼠（体重250～300g，由广西医科大学实验动物中心提供）随机分成4组，每组均为10只大鼠：糖尿病脑病组、生理盐水治疗组、胰岛素治疗组、正常对照组。各组大鼠在建模成功后，均在相同条件下自由饮水和摄食。
1.3 动物模型建立 参照我们已报道的方法［6］,通过腹腔注射链脲佐菌素（55mg/kg，溶于10ml柠檬酸钠缓冲液中，pH=4.4）建立1型糖尿病脑病模型。
1.4 替代治疗方案 参照我们已报道的方法［6］,在建立1型糖尿病脑病模型成功后的第5天，每日上午定时（10:00）对胰岛素治疗组的每只糖尿病脑病大鼠皮下注射鱼精锌蛋白长效胰岛素3IU（溶解于0.5ml的生理盐水中，pH=7.4），连续注射55天；在相同地点和时间点，每日对生理盐水治疗组中的每只糖尿病脑病大鼠皮下注射0.5ml的生理盐水（pH=7.4），连续注射55天；而对于糖尿病脑病组或正常对照组的大鼠则不进行任何处理，存活60天。
1.5 Morris水迷宫行为测定与BrdU注射方案 水迷宫行为测定包括航行定位测试和空间探索实验，具体操作按我们已报道的步骤进行［7］,其结果得到两个指标：逃避潜伏期（s）和游泳距离（cm）；逃避潜伏期越长表示空间学习能力越差，游泳距离越长则表示空间记忆能力越弱。BrdU注射方案的具体操作步骤、剂量和注射途径均与我们已报道的相同［6］。
1.6 组织切片 按我们已报道的方法进行［7］，将经过4%多聚甲醛溶液灌注固定后的大鼠正确安置在大鼠脑体立体定位仪（江湾I型C，上海川沙花木农机厂产品）上，根据大鼠脑立体定位图谱［8］，切取含有海马齿状回的脑组织块，冠状连续冰冻切片，片厚40μm，待进行染色反应。
1.7 免疫组化反应 小鼠抗大鼠BrdU单克隆第一抗体效价为1:1000，具体操作步骤按我们已报道的方法进行［6］，其中阴性对照反应除第一抗体用羊血清替代以外，其余步骤与阳性反应的完全一致，用镍葡萄糖氧化酶法显色。另取邻位切片进行H-E染色，以便正确识别和定位海马齿状回SGZ的层次关系。
1.8 细胞观察和计数 根据大鼠脑立体定位图谱［8］，在各组的大鼠三个脑典型切面上（前囟后3.2mm、3.4mm、3.6mm），对每个断面均选择3张切片作为观察对象，在40×10倍光镜下，根据观察邻位H-E染色切片的结果，再观察BrdU阳性细胞的形态和分布，并计数每张切片左右两侧海马齿状回范围内所有的BrdU阳性细胞，其单位为个/双侧。
1.9 数据统计分析 按照我们已报道的单因素方差分析（ANOVA）方法进行［7］，最后得出的所有数据均以x±s表示。
2 结果
2.1 BrdU阳性细胞形态观察 在观察邻位H-E染色切片的基础上，参照大鼠脑立体定位图谱观察BrdU阳性细胞的形态和分布范围［8］。BrdU免疫反应产物呈黑褐色，定位于细胞核，形态为圆形、卵圆形或椭圆形；绝大多数BrdU阳性细胞位于SGZ层次内，少数位于齿状回门区以及颗粒细胞层内。通过比较各组大鼠BrdU阳性细胞的形态和分布，结果均未发现有明显的差异。以羊血清替代一抗的对照反应结果也均为阴性。
2.2 阳性细胞计数与Morris水迷宫行为测试 有关各组大鼠SGZ神经干细胞（BrdU阳性细胞）数目（个/双侧）以及逃避潜伏期（s）和游泳距离（cm）的变化详见表1。表1 四组大鼠BrdU阳性细胞数与水迷宫行为表现的变化注：*、▲分别表示3个指标与糖尿病脑病组大鼠或生理盐水治疗组大鼠对应指标的比较，P＜0.01
对表1中逐个指标的组间比较可见，糖尿病脑病组和生理盐水治疗组大鼠SGZ的BrdU阳性细胞数最少，但两组的数据差异则无显著性（P＞0.05）；胰岛素治疗组大鼠SGZ的BrdU阳性细胞数则分别较糖尿病脑病组和生理盐水治疗组的明显升高了94.1%～103.5%，三组间的数据差异均有显著性（P＜0.01）；正常对照组BrdU阳性细胞数则分别是糖尿病脑病组或生理盐水治疗组的2倍多，三组数据之间的差异有显著性（P＜0.01）；但正常对照组与胰岛素治疗组之间的差异则无显著性（P＞0.05）。
由表1还可见，糖尿病脑病组和生理盐水治疗组大鼠的逃避潜伏期或游泳距离之间的差异均无显著性（P＞0.05）。然而，胰岛素治疗组大鼠的逃避潜伏期和游泳距离则分别较糖尿病脑病组和生理盐水组下降了56.5%～59.3%以及31.6%～30.1%，三组之间的数据差异均有显著性（P＜0.01）；正常对照组大鼠的逃避潜伏期和游泳距离也分别比糖尿病脑病组和生理盐水治疗组大鼠下降了61.2%～63.7%以及33.2%～31.8%，这些数据之间的差异也均有显著性（P＜0.01）。胰岛素治疗组与正常对照组之间的这两个指标差异均无显著性（P＞0.05）。
3 讨论
单独用BrdU免疫组化方法或者单独用Morris水迷宫行为测试的研究分别揭示，1型糖尿病模型大鼠海马齿状回SGZ神经干细胞增殖能力或空间学习记忆能力明显下降［4，5］，这些结果为深入开展此方面的研究提供了珍贵的资料。然而，若在同一模型基础上，将SGZ神经干细胞增殖与学习记忆两者有机结合起来开展研究，则有可能获得更多的资料。我们沿着这一思路进行了前期针对性的综合研究，并观察到了以下基础性资料：在1型糖尿病脑病大鼠模型中，SGZ神经干细胞增殖能力下降的程度与空间学习记忆能力下降的幅度相一致，提示胰岛素具有促进SGZ神经干细胞增殖和学习记忆的双重功能（另文发表）。
为进一步证实我们前期研究的推测，本研究也通过建立1型糖尿病脑病模型大鼠和胰岛素替代治疗模型大鼠，利用BrdU免疫组化与Morris水迷宫测试方法，分别观察各组大鼠SGZ神经干细胞（BrdU阳性细胞）与空间学习记忆的变化，其结果显示：1型糖尿病脑病模型大鼠空间学习记忆能力与SGZ的BrdU阳性细胞数均明显下降（P＜0.01），在胰岛素替代治疗后，以上指标均明显上升（P＜0.01），并接近正常水平，这些结果不仅与其他学者［4，5］、我们的前期结果（另文发表）相一致，而且印证了胰岛素对神经干细胞增殖和空间学习记忆具有双重的正性功效。
有关胰岛素促进SGZ神经干细胞增殖和空间学习记忆能力的详细机制仍未完全清楚。根据其他学者的研究结果［3，4］，并结合本研究的结果，我们推测，胰岛素可能作为开启或促进SGZ神经干细胞进行源头性第一步骤（增殖和分裂）的关键信号，刺激神经干细胞产生足够数量的新子代细胞，以维持与认知相关的局部神经环路所具有的正常可塑性，确保空间学习记忆功能正常［9］。若胰岛β细胞遭受破坏，长期不能合成或分泌足够量的胰岛素，供应子代细胞的源泉－SGZ神经干细胞，便丧失接受胰岛素这个信息分子的有效刺激，使神经干细胞增殖能力下降或所产生的新子代细胞生存率下降，这将导致局部神经环路中死亡或衰老的细胞得不到新细胞的及时补充。一旦这种源头性的神经干细胞增殖率与局部神经环路中的细胞更新率和修复率之间的动态平衡被长期打破，机体便无法再进行接二连三的有效代偿，最终可引发认识功能障碍。这是否为1型糖尿病脑病的一个发生机制，仍有待于进一步研究。
本研究的结果还提示，在源头上进行干预SGZ神经干细胞的生物学行为则可能收到双重的有利效果：其一是用胰岛素替代治疗1型糖尿病（病因治疗）；其二是借用所替代治疗的胰岛素来防治糖尿病脑病（并发症防治）。由此可得到启示，若能在临床上及早明确诊断出1型糖尿病，根据病人个体内缺乏胰岛素的不同程度，尽快精心设计出个性化的胰岛素替代治疗方案进行干预，将可达到病因治疗和并发症防治的终极目标，这对于降低糖尿病的死亡率和致残率均有重要意义。
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作者单位：广西科学基金资助项目（编号：桂科自0542069） 530021 广西南宁，广西医科大学人体解剖学教研室（※在职硕士研究生，现工作单位：453000 河南新乡，新乡医学院解剖学教研室，△通讯作者）