高效液相色谱法测定天参益智胶囊中去氢紫堇碱的含量

【摘要】  目的 用高效液相色谱法测定天参益智胶囊中去氢紫堇碱的含量。方法 采用DiamonsilTMC18柱（5μm，250mm× 4.6mm），以0.03mol/L的磷酸二氢钾缓冲液-乙腈（74:26）为流动相，检测波长345nm。结果 去氢紫堇碱在0.0765～0.459μg范围内线性关系良好，r = 0.99998，平均回收率为100.5%，RSD为1.36%（n=9）。结论 该方法准确，简便，重现性好，可用于天参益智胶囊中去氢紫堇碱的含量测定。

【关键词】  天参益智胶囊；去氢紫堇碱；高效液相色谱法

 Determination of dehydrocorydaline in Tianshenyizhi capsule with HPLC

    LIANG Yan, BAI Xue, HAO Xiao-yan,et al. School of Pharmacology, Guiyang Medical College, Guizhou 550004, China

    【Abstract】  Objective  To determine the content of dehydrocorydaline in Tianshenyizhi capsule by HPLC.Methods  DiamonsilTMC18 column （ 250×4.6 mm, 5 μm） was used with buffer solution of potassium dihydrogen phosphate （0.03 mol/L）-acetonitrile （74:26） as mobile phase, the detection wavelength was 345nm.Results  Dehydrocorydaline showed a good linear relationship at 0.0765 ～ 0.459 μg, r = 0.999 98. The average recovery was 100.5 % with RSD 1.36 %（n=9）. Conclusion  The method is accurate and simple, with a good reproducibility,and can be used as a quantitative analysis method for this preparation.

    【Key words】  Tianshenyizhi capsule; dehydrocorydaline; HPLC

    阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）又称原发性老年痴呆（Seniledementia），以严重的高级认知功能和记忆功能障碍为临床特征，发病晚期可危及患者生命。AD的病因和发病机制十分复杂，目前有胆碱能损伤学说、自由基损伤学说、兴奋性氨基酸毒性学说等多种观点［1～3］。天参益智胶囊是在中医抗衰老经验方的基础上，研制开发的抗老年性痴呆复方中药。该制剂由天麻、人参、延胡索等药材组成，其中延胡索具有较好的乙酰胆碱酯酶抑制作用，故本论文以其中的去氢紫堇碱作为指标性成分，采用高效液相色谱法测定其含量，以此可作为质量控制的标准。

    1  仪器与试药

    1.1  仪器  HP1100高效液相色谱仪（包括HP1100泵，HP1100紫外检测器，HP1100柱温箱，HP1100/WND-3D工作站），KQ-250B型超声波提取器（昆山市超声仪器有限公司）。

    1.2  试剂与药品  去氢紫堇碱对照品（由贵阳医学院药学院分析化学教研室提供，经紫外、红外、核磁共振波谱鉴定为去氢紫堇碱，由TLC检查、HPLC面积归一化法测定其纯度均大于98%）。乙腈为色谱纯，水为超纯水和蒸馏水，其余试剂均为分析纯。天参益智胶囊（自制，0.3g/粒，批号：200609011、200609012、200609013）。

    2  方法与结果

    2.1  色谱条件  色谱柱：DiamonsilTM C18（5μm, 250mm×4.6mm）；流动相：0.03mol/L的磷酸二氢钾缓冲液-乙腈（74:26）；柱温：30℃；检测波长：345nm；流速：1ml/min；进样量：5μl。

    2.2  供试品溶液的制备  取胶囊内容物1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入1%的盐酸甲醇20ml，称定重量，超声30min，冷却，再称定重量，用1%的盐酸甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

    2.3  对照品溶液的制备  取去氢紫堇碱对照品15mg，精密称定，置20ml量瓶中，加1%的盐酸甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取该溶液1ml，置10ml量瓶中，用1%的盐酸甲醇稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含去氢紫堇碱76.5μg的溶液，即得。

    2.4  阴性样品溶液的制备  取缺延胡索阴性样品粉末约1g，精密称定，按上述“供试品溶液的制备”方法，制备阴性样品溶液。

    2.5  系统适用性试验  分别吸取供试品溶液、对照品溶液和阴性样品溶液，按前述色谱条件测定，结果表明，在此色谱条件下，去氢紫堇碱与其他组分的色谱峰分离度大于1.5，在与去氢紫堇碱色谱峰相同的保留时间内，阴性样品无干扰。理论塔板数按去氢紫堇碱峰计算不低于8000。结果见图1。

    图1  天参益智胶囊的HPLC图谱

    A．去氢紫堇碱对照品；B．缺延胡索阴性样品；C．天参益智胶囊供试品；1．去氢紫堇碱

    2.6  线性关系考察  取“2.3”项下的去氢紫堇碱对照品溶液（76.5μg/ml），分别精密吸取1、2、3、4、5、6μl进样，照前述色谱条件测定峰面积，以进样量（μg）为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，结果表明，去氢紫堇碱在0.0765～0.459μg范围内线性关系良好。回归方程为Y=5 457.104 2X-17.1221，r=0.99998。

    2.7  精密度试验  精密吸取对照品溶液，照前述色谱条件重复进样6次，测得去紫堇碱峰面积积分值的RSD为0.18%（n=6），结果表明测定仪器精密度良好。

    2.8  重复性试验  取同一批样品（批号：200609011）6份，按“供试品溶液的制备”方法制备，照前述色谱条件测定，测得去氢紫堇碱含量平均值为1.00mg/g，RSD为1.86%（n=6），结果表明测定方法重现性良好。

    2.9  稳定性试验  取同一供试品溶液，照前述色谱条件操作，分别在0、2、4、8、12h各进样1次，测得去氢紫堇碱在12h内峰面积的RSD为1.02 %（n=5），结果表明供试品溶液在12h内稳定性良好。

    2.10  回收率试验  取已知含量的同一批样品（批号：200609011，去氢紫堇碱含量为1.00mg/g）约0.5g，共9份，精密称定，分别加入不同量的去氢紫堇碱对照品，按“供试品溶液的制备”方法制备，照前述色谱条件测定，测得去氢紫堇碱的平均回收率为100.5%，RSD为1.36%（n=9），表明测定方法准确可靠。结果见表1。

    2.11  样品测定  取3批样品，按“供试品溶液的制备”方法制备，照前述色谱条件测定，结果3批样品每粒胶囊中去氢紫堇碱含量分别为0.35mg、0.35mg、0.34mg。结果见表2。

    3  讨论

    对延胡索指标性成分的选择，首先从活性的角度考虑，经过活性筛选，笔者首次发现其中的去氢紫堇碱、小檗碱具有乙酰胆碱酯酶抑制活性，而延胡索乙素在这方面的活性则较弱；其次从含量的角度考虑，延胡索中去氢紫堇碱的含量高于小檗碱，所以综合考虑活性与含量的高低，选择了去氢紫堇碱作为延胡索的指标性成分进行了含量测定。所用方法参考了相关的文献资料［4, 5］，对色谱条件经过反复试验进行了适当调整，确定了实验的最佳色谱条件。所建立的HPLC测定方法具有准确、简便、快速、重现性好等特点，有利于本品的质量控制。表1  回收率试验结果表2  样品测定结果

【参考文献】
  1 张兰, 李林.老年痴呆发病机理与药物研究.北京：科学技术文献出版社，2003，160-173.

2 金桂芳, 梅寒芳, 杨红. 阿尔茨海默病的发病机制及药物治疗进展. 广东药学院学报, 2006, 22（6）: 697-700.

3 Frolich L. The cholinergic pathology in Alzheimer’s disease-discrepancies between clinical experience and pathophysiological findings. J Neural Transm, 2002, 109: 1003-1013.

4 陈郁, 颜继忠. 延胡索中生物碱成分的分离与反相高效液相色谱法含量测定. 时珍国医国药, 2006, （07）: 封三-封四.

5 郑晓珂, 冯卫生. 镇心痛口服液中去氢紫堇碱及三七总皂甙的含量测定. 河南中医药学刊, 1999, 14（1）: 20-22.

作者单位：贵州省中药现代化专项资助项目（No. 黔科合中药专字［2004］40号） 550004 贵州贵阳，贵阳医学院药学院（△通讯作者）