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【摘要】 目的 建立盐酸达克罗宁胶浆微生物限度检查方法。方法 采用常规平皿法。结果 采用常规法验证，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉回收率均能达到70%以上，控制菌可检出大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌。结论 盐酸达克罗宁胶浆微生物限度检查，可采用常规法检查细菌数、霉菌和酵母菌总数和控制菌。
【关键词】 微生物限度检查法;常规法
【Abstract】 Objective To establish the microbial limit test for dyclonine hydrochloride mucilage.Methods Plate counting method was used.Results Routine method was used to verify. The recovery rates of escherichia coli, staphylococcus aureus, bacillus subtilis, candida albicans and aspergillus niger were all more than 70%, escherichia coli,pseudomonas aeruginosa and staphylococcus aureus could be examined out in control bacteria.Conclusion The routine method can be used to examine the count of bacterial,molds ,yeasts and control bacterial in microbial limit test of dyclonine hydrochloride mucilage.
【Key words】 dyclonine hydrochloride mucilage; microbial limit test; routine method
盐酸达克罗宁胶浆主要成分为达克罗宁。其化学名称为4-丁氧基-β-哌啶基苯丙酮盐酸盐，摇匀为乳白色粘稠液体，味略苦酸，稍有清凉感，为局部麻醉药，用于上消化道内窥镜检查时的喉头麻醉和润滑，同时祛除腔道内泡沫，使视野清晰。本品为口服兼外用药，未曾有微生物限度检查方法学研究，故按《中国药典》2005年版一部操作方法对其进行微生物限度检查方法学的验证试验，现报告如下。
1 仪器、试药、供试品及菌种
1.1 仪器 CL-32L自动蒸汽灭菌器、SE2020电子天平(梅特勒-托利多常州衡器有限公司)、净化间、净化工作台。
1.2 试药 营养琼脂培养基(批号：0811143)，玫瑰红钠琼脂培养基(批号：080209)，营养肉汤培养基(批号：080110)，胆盐乳糖增菌液(批号：092101)，溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基(批号：080302)，甘露醇氯化钠琼脂培养基(批号：090614)，改良马丁液体培养基(批号：080121)，EMB琼脂培养基(批号：080901)。以上8种培养基均来源于中国北京三科科技开发公司生产。氯化钠(批号：070603)，来源于成都五环高欣试剂厂。MUG培养基(批号：080101)，来源于北京牛牛基因技术有限公司。
1.3 供试品 批号为09013101盐酸达克罗宁胶浆，规格10ml：0.1g，分别制成3份供试品液。
1.4 菌种 大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、铜绿假单胞菌[CMCC(B)10104]菌种均来源于中国药品生物制品检定所。
2 培养基及稀释剂
2.1 培养基的制备 按干燥培养基瓶的标签标示方法配置。
2.2 稀释剂 pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，0.9%氯化钠溶液。按CP05版规定配制及灭菌。
3 方法与结果
3.1 菌液制备 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌落接种于营养肉汤培养基中，30～35℃培养18～24h制成浓菌液，用营养肉汤培养基稀释制成50～100cfu/ml的菌液备用;白色念珠菌接种于改良马丁液体培养基23～28℃培养18～24h，用无菌氯化钠稀释制成50～100cfu/ml的菌液备用;接种黑曲霉新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面，培养5～7天，加入3～5ml 0.9%无菌氯化钠将孢子洗脱，用无菌氯化钠稀释制成50～100cfu/ml的菌液备用。
3.2 供试液制备 取本品10ml按《中国药典》2005年二部附录方法制成1：10供试液备用。
3.3 细菌、霉菌和酵母菌计数方法 按加菌回收方法进行验证(《中国药典》2005年二部附录)。
3.3.1 试验组 供试液1ml 和 50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，每株菌平行试验制备2个平皿进行计数。
3.3.2 菌液组 测定所加的试验菌数。
3.3.3 供试品对照组 取试验组做试验注皿量，测定供试品本底菌数。结果见表1。表1 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证回收试验记录注：回收率%=[(试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)÷菌液组平均菌落数]×100%
根据上述结果，本品大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉平皿法计数细菌、霉菌及酵母菌，回收率均不低于70%，故可以采用常规法进行验证。
3.4 控制菌检查
3.4.1 大肠埃希菌 (1)试验组：取1：10供试液10ml和50～100cfu大肠埃希菌菌液加入100ml胆盐乳糖增菌液，按《中国药典》2005年版一部附录大肠埃希菌检查法检查。(2)供试品组：取1：10供试液加入100ml胆盐乳糖增菌液，按《中国药典》2005年版一部附录大肠埃希菌检查法检查。(3)阴性菌对照组：取1：10供试液10ml和50～100cfu金黄色葡萄球菌菌液加入100ml胆盐乳糖增菌液，按《中国药典》2005年版一部附录大肠埃希菌检查法检查。(4)阴性对照：取10ml pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液加入100ml胆盐乳糖增菌液，按《中国药典》2005年版一部附录大肠埃希菌检查法检查。
3.4.2 金黄色葡萄球菌 (1)试验组：取1：10供试液10ml和50～100cfu金黄色葡萄球菌加入100ml营养肉汤增菌液，按《中国药典》2005年版一部附录金黄色葡萄球菌检查法检查。(2)供试品组：取1：10供试液加入100ml营养肉汤增菌液，按《中国药典》2005年版一部附录金黄色葡萄球菌检查法检查。(3)阴性菌对照组：取1：10供试液10ml和50～100cfu大肠埃希菌菌液加入100ml营养肉汤增菌液，按《中国药典》2005年版一部附录金黄色葡萄球菌检查法检查。(4)阴性对照：取10ml pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液加入100ml营养肉汤增菌液，按《中国药典》2005年版一部附录2005年版一部附录金黄色葡萄球菌检查法检查。
3.4.3 铜绿假单胞菌 (1)试验组：取1：10供试液10ml和50～100cfu铜绿假单胞菌菌液加入100ml胆盐乳糖增菌液，按《中国药典》2005年版一部附录铜绿假单胞菌检查法检查。(2)供试品组：取1：10供试液加入100ml胆盐乳糖增菌液，按《中国药典》2005年版一部附录铜绿假单胞菌检查法检查。(3)阴性菌对照组：取1：10供试液10ml和50～100cfu大肠埃希菌菌液加入100ml胆盐乳糖增菌液，按《中国药典》2005年版一部附录铜绿假单胞菌检查法检查。(4)阴性对照：取10ml pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液加入100ml胆盐乳糖增菌液，按《中国药典》2005年版一部附录铜绿假单胞菌检查法检查。结果见表2～4。
3.5 结果判断 试验组应检出试验菌，阴性菌对照组不得检出阴性对照菌，该试验方法成立。表2 控制菌检查方法验证记录大肠埃希菌结果 取1：10的供试液10ml加入100ml BL中，其他操作按大肠埃希菌检查法，3次平行试验试验组检出大肠埃希菌，阴性菌对照组未检出金黄色葡萄球菌 表3 铜绿假单胞菌验证方法记录结论 取1：10的供试液10ml加入100ml BL中，其他操作按铜绿假单胞菌检查法，3次平行试验试验组检出铜绿假单胞菌，阴性菌对照组未检出大肠埃希菌注：+：生长典型铜绿假单胞菌： -：无菌生长结论 取1：10的供试液10ml加入100ml 营养肉汤中，其他操作按金黄色葡萄球菌检查法，3次平行试验试验组检出金黄色葡萄球菌，阴性菌对照组未检出大肠埃希菌 注：+：生长典型金黄色葡萄球菌： -：无菌生长
4 讨论
本研究验证的目的是检验其方法的灵敏度、检出率(能否检出，方法可行性)。以确定检验方法的专属性，以确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查法。
由于药品中的污染菌种类繁多，不同药品对不同种类的细菌、霉菌的抑制作用强弱不同，不同药品处方成分及其各成分的量不同因素，对微生物的生长影响。因此，在药品的微生物限度检查时，要考虑诸多因素对方法的影响，对方法的可靠性经验证：生产企业在原料、辅料、生产和检验等条件不变的情况下，盐酸达克罗宁胶浆微生物限度检查可按以下方法进行检验，1ml/皿，测定细菌数;1ml/皿，测定霉菌和酵母菌总数。按2005年版《中国药典》一部微生物限度检查法大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌。铜绿假单胞菌检查法检验控制菌。
【参考文献】
1 国家药典委员会.中国药典.北京：化学工业出版社，2005,4.
2 马绪荣，苏德模.药品微生物检验手册.北京：科学出版社，2000,387.
作者单位：550001 贵州贵阳，贵州省药品检验所