柔毛淫羊藿对去卵巢小鼠IL-1β的影响

【摘要】  目的 观察柔毛淫羊藿对去卵巢小鼠股骨IL-1β的影响。方法 切除雌性小鼠双侧卵巢制备骨质疏松动物模型，随机分为模型组、己烯雌酚组及柔毛淫羊藿高、中、低剂量组，另设对照组(假手术组)。各组给予相应药物，60天后用免疫组织化学方法观察其骨组织内IL-1β的表达。结果 与模型组比较，柔毛淫羊藿高、中、低剂量组动物IL-1β表达明显降低。结论 降低IL-1β水平可能是柔毛淫羊藿抗骨质疏松作用的重要机制之一。

【关键词】  柔毛淫羊藿;去卵巢小鼠;骨质疏松;IL-1β

The effect of Epimedium pubescens Maxim on IL-1β in ovariectomized mice

　　ZUO Fei-wu, ZHOU Ning, WU Pei-yao, et al.The People’s Hospital of Weining County, Guizhou 553100,China

　　【Abstract】 Objective To investigate the effect of Epimedium pubescens Maxim on IL-1β in ovariectomized mice.Methods The ovariectomized model was made by cutting off two side of ovary. The female mice were randomly divided into model group, diethylstilbestrol group and high, middle, low dose of Epimedium pubescens Maxim groups, set up the control group in addition. The mice were given corresponding medicine, 60 days later, to observe the changes of expression of IL-1β in bone tissue by immunohistochemistry.Results Comparing to model group, the expression of IL-1β reduced obviously in animal of high, middle, low dose of Epimedium pubescens Maxim groups.Conclusion Reducing the expression level of IL-1β may be one of the important mechanisms that the effect of Epimedium pubescens Maxim resisting osteoporosis.

　　【Key words】 Epimedium pubescens Maxim; ovariectomized mice; osteoporosis; IL-1β

　　淫羊藿具有温肾壮阳、强筋骨、祛风湿的功效。其复方制剂被广泛用于骨质疏松症的治疗。近期已有研究报道，柔毛淫羊藿可明显改善去卵巢骨质疏松小鼠骨组织形态计量学指标[1]，且具有拟雌激素样作用[2]。本文用免疫组化方法观察了柔毛淫羊藿对去卵巢小鼠白介素-1β(IL-1β)的影响，以期进一步探讨其作用机制。

1 资料与方法

　　1.1 实验材料 昆明种小鼠，雌性，体重18～22g，由贵阳医学院动物中心提供，合格证号：SCXK(黔)2002-0001;柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens Maxim)：采自四川省中江县，由中国医学科学院药用植物研究所鉴定。实验用其浸膏，1g浸膏相当于生药量 6.28g。己烯雌酚：合肥久联制药有限公司，批号20060518;兔抗鼠IL-1β多克隆抗体：武汉博士德生物工程有限公司，批号BA1098;即用型5%BSA封闭液：武汉博士德生物工程有限公司;抗体稀释液：武汉博士德生物工程有限公司，批号AR1016; 内源性过氧化物酶阻断液：武汉博士德生物工程有限公司，批号AR1108;即用型链霉素亲和过氧化物酶复合物(SABC)免疫组化试剂盒：武汉博士德生物工程有限公司，批号SA2002;DAB显色剂：武汉博士德生物工程有限公司，批号AR1022;甲醛溶液：重庆茂业化学试剂有限公司，批号20070316; 10%中性福尔马林: 40%甲醛溶液120ml，NaH2PO4·2H2O 4g，Na2HPO4·12H2O 13g，加蒸馏水至1000ml混匀，调节pH至7.0;骨密度仪：美国通用电气有限公司;BI-2000医学图像分析系统：成都泰盟有限公司。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 骨质疏松动物模型的制作[3] 动物用戊巴比妥钠按40mg/kg体重腹腔注射(ip)麻醉，无菌条件下摘除双侧卵巢，关闭腹腔。术后 ip 青霉素(4万单位/kg)。对照组(假手术组)动物同法摘除卵巢旁同样大小的脂肪组织。

　　1.2.2 分组与给药 造模后，将造模小鼠分为5组：模型组(等容积生理盐水)、己烯雌酚组(2mg/kg)、柔毛淫羊藿高剂量组(柔高组:200mg/kg)、柔毛淫羊藿中剂量组(柔中组:100mg/kg)、柔毛淫羊藿低剂量组(柔低组:50mg/kg)，加上假手术组(等容积生理盐水)实验动物共分为6个组，每组14只。各组动物按各自药物和剂量灌胃给药(ig)，每日1次，连续60天，期间每周2次根据体重调整药量。

　　1.2.3 IL-1β的测定 末次给药次日，取小鼠右股骨于10%中性福尔马林固定，常规脱水、包埋、切片。石蜡切片常规脱蜡，梯度酒精逐级水化;3% H2O2灭活内源性过氧化物酶;高压抗原修复;PBS洗3次;封闭血清封闭 20min，滴加一抗4℃过夜;PBS洗3次，滴加二抗 37℃反应 30min，PBS洗3次;滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素反应液，37℃反应 20min，PBS洗3次;滴加DAB显色，镜下观察及时终止反应;苏木素复染;常规脱水透明，中性树胶封片镜检。免疫组化染色结果经BI-2000医学图像分析系统进行分析。每张切片随机选择9个视野(400倍)进行阳性细胞计数。

　　1.3 数据处理 数据以均数±标准差(x±s)表示，采用SPSS11.5统计软件包进行数据处理，各组间两两比较采用LSD(Least-significant difference)法。

2 结果

　　2.1 对IL-1β表达的影响 阳性表达信号为细胞出现黄褐色颗粒的染色, 主要定位于胞质，分布于单核巨噬细胞和破骨细胞。镜下可见模型组IL-1β阳性染色深度显著，己烯雌酚组、柔高组及柔中组染色深度明显变浅(见图1)。

　　2.2 对IL-1β阳性细胞数的影响 与假手术组比较，模型组动物的 IL-1β阳性细胞数明显增加(P<0.01);与模型组比较，柔毛淫羊藿高、中、低剂量组动物IL-1β阳性细胞数明显降低(P<0.01)，见表1。表1 柔毛淫羊藿对IL-1β阳性细胞数的影响注：与假手术组比较，△△P<0.01;与模型组比较，**P<0.01

　　3 讨论

　　去卵巢是复制骨质疏松的经典模型[3]，与绝经后和切除卵巢的骨质疏松患者之病理过程极为相近。在本实验小组的其他研究(柔毛淫羊藿对去卵巢小鼠骨密度及生物力学指标的影响)以及相关文献[1，2]的报道，也充分证实了采用雌性小鼠去卵巢复制骨质疏松模型的可靠性。

　　白介素1(IL-1)是雌激素缺乏时骨丢失的重要的诱发因子之一[4]，IL-1的含量在骨髓局部微环境中的升高以及活性增加,会刺激骨髓单核细胞向破骨细胞转化,使破骨细胞的数目增多,骨吸收活性增强。骨质疏松发生后，骨微环境中白介素-1β (interleukin-1β，IL-1β)的相对稳定状态被破坏，打破骨改建活动的内在平衡，引起骨代谢活动的紊乱导致骨质疏松[5]。实验中,IL-1β主要表达于去卵巢小鼠骨髓基质的单核细胞及巨噬细胞中，这与邓廉夫等[6，7]的报道一致。柔毛淫羊藿使骨组织IL-1的表达降低。提示柔毛淫羊藿的抗骨质疏松作用可能与降低IL-1β水平，促进成骨细胞增殖，造骨能力增强相关。

【参考文献】
  　1 吴培要，任光友，张贵林. 柔毛淫羊藿对去卵巢小鼠骨组织形态计量学的影响.中华医药杂志，2009,9(1):25-27.

　　2 任光友，李玲，陈晓霞，等.柔毛淫羊藿的拟雌激素作用研究. 贵州医药,2009,33(4):348-350.

　　3 沈薇，隋璐，苏禄晖. 实验性骨质疏松症小鼠模型的建立. 沈阳医学院学报，2006,8(4):245-246.

　　4 张勇，陈苏民.去势大鼠骨中BMP-2，BMP-7基因的表达. 第四军医大学学报，2000,21(1)：125-126.

　　5 安贵峰，屠冠军.骨质疏松模型骨组织中IL-6，IL-1β，TNF-α的表达特征.中国医科大学,2005, 2(34):97-99.

　　6 邓廉夫，何涛.骨质疏松症破骨细胞的形成与骨吸收活性的研究.江苏医药杂志,2002,28:563-565.

　　7 郭世绂.骨质疏松基础与临床.天津：天津科技出版社,2001，129.