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首页医源资料库在线期刊中华医药杂志2010年第10卷第1期

顺铂对人胃腺癌SGC-7901细胞的作用及意义

来源:中华医药杂志
摘要:【摘要】目的研究顺铂对人胃腺癌SGC-7901细胞的作用及与MT1H、ERCC1表达的相关性,探讨MT1H、ERCC1表达在顺铂耐药中的作用。方法MTT法检测顺铂对人胃腺癌SGC-7901细胞的增殖抑制作用。采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术检测不同时间、不同浓度顺铂作用后,人胃腺癌SGC-7901细胞中MT1H、ERCC1表达的变化。结果......

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【摘要】  目的 研究顺铂对人胃腺癌SGC-7901细胞的作用及与MT1H、ERCC1表达的相关性,探讨MT1H、ERCC1表达在顺铂耐药中的作用。方法 MTT法检测顺铂对人胃腺癌SGC-7901细胞的增殖抑制作用;采用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术检测不同时间、不同浓度顺铂作用后,人胃腺癌SGC-7901细胞中MT1H、ERCC1表达的变化。结果 随着顺铂浓度的增高,对人胃腺癌SGC-7901细胞的抑制作用逐渐增强,24h IC50=14μmol/L,48h IC50=18μmol/L;2.5μmol/L时MT1H mRNA、ERCC1 mRNA表达开始增高(26.29%±3.46%、44.00%±1.37%),40μmol/L时最高,分别为对照组的2.82和2.19倍,与对照组比较,差异均有显著性(P均<0.05);20μmol/L顺铂分别作用12h后人胃腺癌SGC-7901细胞MT1H mRNA、ERCC1 mRNA的表达开始增加,72h时表达最高(63.75%±5.63%、93.77%±3.53%),与对照组(23.40%±2.99%、34.65%±4.56%)相比,差异均有显著性(P均<0.05)。结论 顺铂对人胃腺癌SGC-7901细胞的抑制作用呈剂量依赖性;随着DDP浓度及作用时间的延长,人胃腺癌SGC-7901细胞ERCC1 mRNA和MT1H mRNA表达量增加,推测MT1H、ERCC1可能参与了继发耐药。

【关键词】  切除修复交叉互补基因1;金属硫蛋白1H;顺铂耐药

         Effect and significance of cisplatin in human gastric adenocarcinoma cell SGC-7901SHEN Li-qin ,JIAO An-na,ZHUANG Zhi-xiang.Department of Oncology,the Affiliated Second Hospital of Soochow University,Suzhou 215004,China【Abstract】 Objective To study the relationship between MT1H,ERCC1 expression and cisplatin intervention in human gastric adenocarcinoma cell SGC-7901.Methods The way of methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) was used to measure the anticancer activity;we measured the expression of MT1H,ERCC1 by RT-PCR in human gastric aden- ocarcinoma cell SGC-7901 which was treated with cisplatin for different concentration and different hours.Results When treating with cisplatin for 24 or 48 hours,the IC50 of the human gastric adenocarcinoma cell SGC-7901 was 14μmol/L and 18μmol/L, respectively. After treating with 2.5μmol/L cisplatin for 24 hours,the expression of MT1H mRNA,ERCC1 mRNA increased with the level of 26.29%±3.46% and 44.00%±1.37%,respectively.And the expression of MT1H mRNA and ERCC1 mRNA reached the top when SGC-7901 cells were treated with 40μmol/L cisplatin. After treating with 20μmol/L cisplatin for 12 hours,the expression of MT1H mRNA,ERCC1 mRNA increased in SGC-7901 cell,and reached the top in 72 hours with the level of 63.75%±5.63% and 93.77%±3.53%, respectively.Conclusion The effect of cisplatin in human gastric adenocarcinoma cell SGC-7901 is of concentration-dependentment; MT1H and ERCC1 may be involved in the cisplatin resistance in gastric carcinomor.

  【Key words】 ERCC1;MT1H;drug resistance to cisplatin

  近年来,有充分的证据证明金属硫蛋白1H(MT1H)、切除修复交叉互补基因(excision repair cross- complementing 1,ERCC1)表达增高直接介导了肿瘤对铂类的耐药,这在非小细胞肺癌、卵巢癌等肿瘤细胞学和分子生物学中已有大量研究,在胃癌细胞学方面的研究较少,鉴于此,笔者利用RT-PCR技术检测不同浓度DDP及不同作用时间干预后人胃腺癌SGC-7901细胞ERCC1 mRNA和MT1H mRNA表达的变化,并分析其与顺铂耐药的相关性。

  1 对象与方法

  1.1 细胞系 人胃腺癌SGC-7901细胞株由苏州大学附属第二医院中心实验室馈赠(购自中国科学院上海细胞生物学研究所)。

  1.2 实验试剂及仪器 注射用顺铂(山东齐鲁制药厂),TRIZOL(Invitrogen公司),M-MLV、RNA酶抑制剂(TaKaRa宝生物工程有限公司),TaqDNA聚合酶、MgCl2(Fermentas公司),dNTP(罗氏公司),MTT(南京凯基生物工程有限公司),德国EppendorfPCR仪,DYY-6C型电泳仪,凝胶成像系统(Tanon天能科技有限公司),SynergyTM系列多功能酶标仪(BioTek公司)。

  1.3 引物的设计与合成 引物为上海生工生物工程技术服务有限公司合成。MT1H引物为:P1:5′TCTTCTCGCTTGGGAACTCCAGTCTCACCTCG3′;P2:5′ACGTGTCATTCTGTTTTCATCTGACAGCAGGG3′,扩增片段大小为268bp。ERCC1引物为:上游:5’AGATGGACCCTGGGAAGGACAAAG3′,下游:5′GGGGTCATCAGGGTACTTTCAAG3′, 扩增片段为894bp。β-action(作为内参照)引物为:P1:5′C- ATCCTGCGTCTGGACCT3′;P2:5’TCAGGAGGAGCAATGATCTTG3′,扩增片段为480bp。

  1.4 MTT法检测人胃腺癌SGC-7901细胞抑制率 收集对数生长期人胃腺癌SGC-7901细胞,调整细胞悬液浓度,调整细胞密度,接种细胞至96孔培养板上,5%CO2,37℃孵育24h后,不同浓度顺铂(0、2.5、5、10、20、40μmol/L)处理培养24h,每组设5个复孔。加顺铂继续5%CO2,37℃孵育24h后,每孔加入50μl 1×MTT(由5×MTT稀释),继续培养4h,每孔加入150 ul二甲基亚砜,用酶标仪检测490nm处各孔吸光(OD)值。细胞生长抑制率(%)=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%,细胞存活率(%)=实验组OD值/对照组OD值×100%。以草酸铂浓度为横轴,细胞抑制率为纵轴,绘制工作曲线。

  1.5 RT-PCR技术检测顺铂作用人胃腺癌SGC-7901细胞后MT1H mRNA、ERCC1 mRNA的表达

  1.5.1 细胞学实验分组 0、2.5、5、10、20、40μmol/L的顺铂作用人胃腺癌SGC-7901细胞24h;10μmol/L顺铂作用人胃腺癌SGC-7901细胞0、12、24、48、72h。

  1.5.2 RT-PCR技术检测MT1H mRNA、ERCC1 mRNA水平 用TRIZOL等试剂提取细胞总RNA,电泳和紫外分光光度法检测提取的RNA含量与纯度。使用M-MLV逆转录酶将总RNA逆转录成cDNA,分别PCR扩增ERCC1、MT1H基因和内参基因β-actin。用1%琼脂糖凝胶电泳分离,用凝胶成像系统及AlphaEaseFC软件测定MT1H基因、ERCC1基因、B-actin基因的灰度比,作为MT1H、ERCC1基因的相对表达水平。

  1.6 统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件包进行统计学处理。半定量结果用x±s表示,经方差齐性检验后行t检验。检验水准P<0.05。

  2 结果

  2.1 顺铂对人胃腺癌SGC-7901细胞抑制率的测定 人胃腺癌SGC-7901细胞顺铂作用24h IC50=14μmol/L,48h IC50=11μmol/L(见图1、2)。随着顺铂浓度的增加,人胃腺癌SGC-7901细胞的增殖活性逐渐降低,对人胃腺癌SGC-7901细胞的抑制作用逐渐增强。顺铂浓度与细胞抑制率之间存在剂量依赖关系,顺铂浓度增加,细胞抑制率升高。

  2.2 不同浓度顺铂作用人胃腺癌SGC-7901细胞后MT1H mRNA、ERCC1 mRNA的表达 随着顺铂浓度的增加,MT1H mRNA的表达量逐渐增加,呈剂量依赖性。2.5μmol/L时MT1H mRNA、ERCC1 mRNA表达开始增高(26.29%±3.46%、44.00%±1.37%),与对照组(18.84%±3.67%、32.96%±1.71%)比较,差异有显著性(P均<0.05)。40μmol/L时最高,分别为对照组的2.82和2.19倍,与对照组比较,差异均有显著性(P均<0.05)(见图3、4)。

  2.3 顺铂作用不同作用时间后人胃腺癌SGC-7901细胞后MT1HmRNA、ERCC1 mRNA的表达 20μmol/L顺铂分别作用12h后人胃腺癌SGC-7901细胞后MT1HmRNA、ERCC1 mRNA的表达即开始增加,随着作用时间的延长,细胞MT1HmRNA、ERCC1 mRNA表达量也逐渐增高,12、24、48、72 h分别为(38.73%±2.37%、60.48%±4.26%),(41.61%±5.09%、66.04%±4.66%),(49.31%±6.20%、73.24%±5.01%),(63.75%±5.63%、93.77%±3.53%)(见图5、6、7) ,与对照组(23.40%±2.99%、34.65%±4.56%)相比,差异均有显著性(P均<0.05)。

  3 讨论

  研究认为,顺铂进入肿瘤细胞后与DNA结合,形成铂-DNA加合物(Pt-DNA加合物),导致DNA链内或链间交链,干扰DNA转录和复制,从而抑制肿瘤细胞的分裂,引起DNA致死性损伤[1]。肿瘤细胞耐药的机制主要有以下几个方面:肿瘤细胞内药物蓄积减少,肿瘤细胞DNA修复能力增加、P-糖蛋白表达增加和细胞解毒体系含巯基分子的过量表达。

  大量研究证实,肿瘤细胞耐药与细胞解毒体系含巯基分子的过量表达有关,细胞内含巯基蛋白主要以金属硫蛋白(MT)为主,MT在肿瘤组织中表达是癌细胞对化疗药物耐药的机制之一[2], MT1H是MT功能性基因之一。DNA损伤主要通过核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)途径修复,而ERCC1在NER中起关键作用[3]。多个研究表明,MT1H、ERCC1在肿瘤耐药,尤其是铂类耐药中起了重要作用,参与了原发或继发耐药,这已引起广泛关注[4~6]。

  本实验以人胃腺癌SGC-7901细胞为研究对象,实验结果显示,随着顺铂浓度的增加,MT1H、ERCC1基因的表达也相应增加,且呈现剂量依赖性;随着顺铂作用时间的延长,人胃腺癌SGC-7901细胞中MT1H、ERCC1表达也逐渐增加。这与国内夏莹等对人肺腺癌A549细胞的研究有些不同,他们认为随着DDP浓度的增加,ERCC1表达水平逐渐上升,但到一定浓度(40μmol/L)时其表达水平反而下降,而本文的实验显示顺铂40μmol/L作用SGC-7901细胞后,MT1H、ERCC1表达水平高于其他浓度组,考虑与实验所用细胞株及实验方法不完全一样所致。

  总之,随着顺铂浓度的增加及作用时间的延长,人胃腺癌SGC-7901细胞MT1H mRNA、ERCC1 mRNA的表达量增加,推测MT1H、ERCC1可能参与了顺铂的继发性耐药。

【参考文献】
  1 Cepeda V,Fuertes MA,Castilla J, et al. Biochemical mechanisms of cisplatin cytotoxicity. Anticancer Agents Med Chem, 2007,7(1):3-18.

  2 Lynn NN, Howe MC, Hale RJ, et al. Over exp ression of metallothionein predicts resistance of transitional cell carcinoma of bladder to intravesical mitomycin therapy. J Urol, 2003, 169: 721-723.

  3 Tripsianes K, Folkers G,Ab E, et al. The structure of the human ERCCl/XPF interaction domains reveals a complementary role for the two p roteins in nucleotide excision repair. Structure, 2005, 13(12): 1849-1858.

  4 Olaussen KA,Dunant A,Fouret P,et a1.DNA repair by ERCC1 in non-mall-cell lung cancer and cisplatin-based adjuvant chemotherapy.N Engl J Med,2006,355(10):983-991.

  5 Li Q, Yu JJ,Mu C, Slavsky D, et al. Association between the level of ERCC1 expression and the repair of cisplat-ininduced DNA damage in human ovarian cancer cells. Anticancer Res, 2000, 20 (2A):645.

  6 Lazo JS,Kuo SM,Woo ES,et al. The protein thtol metallothionein as an antioxidant and protectant against antineoplastic drugs.Chem Bio Intert, 1998,111-112,255-262.

作者: 沈丽琴,焦安娜,庄志祥 2011-6-29
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