点击显示 收起
【关键词】 诱导性 多潜能细胞干细胞(iPS) 安全性 诱导效率
诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS cells)是指通过基因重新编排方法，“诱导”普通细胞回到最原始的胚胎发育状态，能够像胚胎干细胞一样进行分化，这样的细胞就称为“iPS”。iPS细胞2006年日本Yamanaka研究小组命名的，他们把经过多重筛选的Oct-4、Sox2、Klf4及c-Myc四个基因通过逆转录病毒介导转入鼠的成纤维细胞,将其重新编程，结果得到了类似胚胎干细胞(ES)细胞的具有多分化潜能的干细胞,并将该类干细胞命名为iPS细胞[1]。这一发现分别被《Nature》和《Science》杂志评为2007年第一和第二大科学进展。由于iPS与ES不同，不需要损毁胚胎，因而避免了阻碍ES研究发展的伦理道德问题，而且由于具有个体来源的特异性，这就不涉及免疫排斥，所以具有广泛而且重要的基础研究和临床应用价值。目前iPS的相关研究已经成为一个热点，世界上众多实验室都在从各个角度探讨其机制和应用，并且多方验证了建立iPS细胞的可重复性。但总的来说，iPS的研究还处于初级阶段，如何成功建立iPS细胞仍存在很多问题，本文将结合近几年相关研究进行概述，针对现阶段存在的两个主要问题—iPS细胞安全性以及诱导效率做一分析。
1 安全性问题
近两年来，世人对iPS细胞的关注之所以呈爆炸式的增长，主要是由于它在临床治疗上巨大的潜在前景，建立安全、高效的iPS细胞来治疗疾病是人们的最终目标。
Yamanaka最早建立iPS细胞，这些细胞表达ES细胞的特异性标志基因，也可以在免疫缺陷性小鼠产生畸胎瘤，瘤中有来自三个胚层的组织;还可以形成嵌合体，但最终没有得到成活的嵌合体小鼠[1]。这主要是由于他采用的逆转录病毒载体会插入突变，使小鼠细胞发生遗传修饰以及四个因子中c-Myc是致癌基因，而且Klf4也有一定的致癌能力[2,3]。事实上也有研究证明：病毒介导的c-Myc的再次激活增加了iPS起源嵌合鼠发生肿瘤的机会[4,5]。
为了降低iPS细胞的致瘤性，研究者也从多方面改进构建iPS细胞的方法，主要有两种方式：一是弃用致癌基因;一是寻求安全的基因导入方式。
2007年Thomson 小组利用Oct-4、Sox2、Nanog 和Lin28 4 种基因将人的体细胞重构为iPS 细胞[6]，首先证明了不用致癌基因c-Myc和Klf4也能够成功诱导。之后，Nakagawa 小组[5]和Wernig 小组[7]对这三个因子的尝试也取得了成功。尽管不用c-Myc 导致诱导iPS 细胞的效率显著降低, 但得到iPS 细胞的多潜能性和质量较好, 且得到的iPS 后代小鼠在出生100天后没有形成肿瘤。最近诸多的研究表明，仅用2种基因也可以成功诱导iPS 细胞，不过必须有小分子化合物的参与。Feng小组[8]用Essrb 替代c-Myc 和Klf4 这两个潜在的致癌因子,与Oct-4 和Sox2 共同作用可有效地把胎鼠成纤维细胞重编程为iPS 细胞;Huangfu D小组[9]发现用组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂(VPA,丙戊酸)不仅可将只有Oct-4与Sox2两个转录因子转染的成纤维母细胞诱导成iPS细胞,而且可以将其重编程率提高到1%。甚至Kim等人[10]报道,只用Oct4 一个因子就可以将成年小鼠的神经干细胞(neural stem cells, NSCs)重编程为iPS 细胞，因为NSCs 表达Sox2 和Klf4。
目前为止，可将转录因子基因导入体细胞而获得iPS 细胞主要有以下几种方式：逆转录病毒[1]、慢病毒[6]、腺病毒[11]、转座子[12]和质粒[13]。逆转录病毒和慢病毒介导的转基因方式使病毒载体整合进宿主基因组，实现转基因稳定表达，但这两种转基因方式容易激活致癌基因;而通过腺病毒将转录因子基因导入体细胞，瞬时表达这些转录因子，这种基因导入方式一般不会使病毒载体整合进宿主基因组中，但一是该方法将体细胞诱导为iPS 细胞的效率较逆转录病毒和慢病毒的低许多[11]，再者，实际上腺病毒载体也有可能整合进基因组中，尽管这种可能性很小，这也不是最好的方法;通过转座子和质粒介导的原理是通过其介导表达4 个因子，诱导并建立iPS 细胞系, 然后在这些iPS 细胞中瞬时表达转座酶以切除外源性诱导因子，这样的iPS细胞就不再表达外源性诱导因子, 不引起基因组DNA 序列的任何变化，安全性有所提高。但在建立iPS 细胞过程中转座子的插入对iPS 细胞安全性的长期效应, 还有待更进一步来验证。
能不能完全避免整合性病毒或者转座子的使用，建立一种更安全的方法来建立iPS 细胞呢?可喜的是，在今年几乎同时，Zhou H小组[14]和Kim D小组[15]在《Cell Stem Cell》上介绍了一种新的方法，通过蛋白质直接介导，分别把小鼠和人的成纤维细胞诱导成为iPS 细胞。就是将设计好的一小段能够穿过细胞膜的肽链连接到重编程因子蛋白上, 这种融合蛋白可穿透细胞膜而进入细胞内部, 进而执行其重编程的功能。不同的是Zhou H小组在试验中加入了小分子化合物VPA(丙戊酸)来改善重编程效率，而Kim D小组没有加入任何物质。因为这种蛋白直接诱导的方式不涉及任何遗传修饰，所以就目前来看，这是最安全的方法。综上可知，通过不断地摸索，iPS 细胞的安全性正在逐步提高，但以上方法在提高安全性的同时，都使得iPS 细胞的诱导效率大大降低。
2 诱导效率问题
现阶段，iPS 细胞的获得效率很低，大约万分之几到千分之几，为了有效获得更多数量的iPS细胞，研究者尝试了多种方法。综合来看，与iPS 细胞的获得效率密切相关的主要有以下几点。
2.1 小分子化合物的参与 越来越多的研究表明，通过不同转录因子的组合或者与小分子化合物联用，都可以极大提高鼠和人体细胞重编程为iPS 细胞的效率，这些小分子化合物在促进细胞重编程方面起重要作用。而当在培养液中加入小分子化合物BIX 或PD0325901 与CHIR99021，则可显著提高重编程效率[16]。组蛋白甲基转移酶G9a 的抑制剂BIX-01294 最早被发现可替代Oct-4, 与其余的3 个重编程因子一起诱导NPCs 形成iPS 细胞。此外, BIX-01294 还可提高Oct-4 和Klf4 两个因子重编程NPCs 的效率[16]。另外, Park 等人[17]在只用4 个重编程因子诱导健康成年人的皮肤成纤维细胞没有形成iPS 细胞后,在4个因子的基础上加入hTERT 和SV40 大T 抗原, 能够从健康成年人成纤维细胞诱导形成iPS 细胞。小鼠成熟B 细胞需要导入髓系转录因子C/EBPα才能转化成iPS 细胞[18]，而当在培养液中加入5-AZA亦可将成熟B 细胞诱导为iPS 细胞[19]。最近Hyenjong Hong等[20]发现，通过阻断一个名为“p53”的基因的路径，可以将皮肤细胞转化为iPS细胞的成功率提高至10%左右，是原有转化率的大约百倍。不过他们提醒说：“p53”具有抑制细胞癌变、阻止肿瘤生长的作用，因此在通过阻断“p53”路径提高iPS细胞转化率时，也要注意潜在风险。
2.2 不同组织来源的体细胞其诱导效率不同 Aasen等人[21]研究表明，以从发根鞘部位生发的角质层表皮干样细胞为供体细胞，同样通过逆转录病毒介导表达Oct-4、 Sox2、 Klf4及c-Myc，成功诱导iPS 细胞形成，并经过mRNA水平检测，发现其诱导效率与成纤维细胞相比，大约提高了100倍，而且iPS克隆出现的时间也缩短至10天，出现速度也提高了近两倍。
除此两点之外，信号转导通路的激活，如Wnt通路[22];表观遗传信息的修饰[9]都可以提高iPS 细胞形成效率。
导致体细胞重编程为iPS 细胞效率低下的原因主要是因为现阶段对其相关的分子机制的研究尚不清楚。由于成体细胞通过去分化途径重编程为iPS 细胞是一个缓慢而复杂的过程，有诸多分子参与其中。而Oct-4、 Sox2、 Klf4及c-Myc这四个基本因子在iPS 细胞形成过程中的作用机制也尚不明确。再者，即使是最通用的通过病毒转染方式来诱导，其转染效率也并非100%，而同时表达四个因子的细胞比例就更低了。此外，这四个因子诱导得到全能iPS 细胞也属于随机事件，而该事件依赖于体细胞中Oct-4等干性转录因子随机发生的渗漏表达以及表观遗传学的随机性变化[23,24]。试想如果能够选择合适的成体细胞作为重编程起始细胞，加入恰当的小分子化合物来催化，把这种随机事件变成必然事件，必然会高效率的诱导iPS 细胞的形成。
总之，就目前情况来看，提高iPS 细胞的安全性似乎与高效率的诱导iPS 细胞生成相互矛盾，但相信随着研究的不断深入，iPS 细胞重编程和多能性的分子调控机制会逐渐清晰。高效、安全地建立iPS 细胞系对更加充分的基础研究以及临床的早日应用，最终为患者带去福音具有重要意义。
【参考文献】
1 Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell, 2006, 126: 663-676.
2 Meyer N, Penn L Z. Reflecting on 25 years with MYC. Nat Rev Cancer, 2008, 8: 976-990.
3 Rowland B D, Peeper D S. KLF4, p21 and context-dependent opposing forces in cancer. Nat Rev Cancer, 2006, 6: 11-23.
4 Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. Generation of germline - competent induced pluripotent stem cells. Nature, 2007,(448):313-317.
5 Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, et al. Generation of induced pluripotent stem cellswithoutMyc from mouse and human fibroblasts. Nature Biotechnol, 2008,(26):101-106.
6 Yu J, Vodyanik M A, Smuga-Otto K, et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science, 2007, 318(5858): 1917-1920.
7 Wernig M, Meissner A, Cassady J P, et al. c-Myc is dispensable for direct reprogramming of mouse fibroblasts. Cell Stem Cell, 2008, 2(1): 10-12.
8 Feng B, Jiang J, Kraus P, et al. Reprogramming of fibroblasts into induced pluripotent stem cells with orphan nuclear receptor Esrrb. Nat Cell Biol, 2009, 11: 197-203.
9 Huangfu D, Maehr R, Guo W, et al. Induction of pluripotent stem cells by defined factors is greatly improved by small-molecule compounds. Nat Biotechnol, 2008, 26: 795-797.
10 Kim J B, Sebastiano V, Wu G, et al. Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells. Cell, 2009, 136: 411-419.
11 Stadtfeld M, Nagaya M, Utikal J, et al. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration. Science, 2008, 322(5903):945-949.
12 Woltjen K, Michael I P, Mohseni P, et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature,2009, 458(7239): 766-770.
13 Kaji K, Norrby K, Paca A, et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature, 2009, 458: 771-775.
14 Zhou H, Wu S, Joo J Y, et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell, 2009, 4:381-384.
15 Kim D, Kim C H, Moon J I, et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.Cell Stem Cell, 2009, 4: 472-476.
16 Shi Y, Do J T, Desponts C, et al. A combined chemical and genetic approach for the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell, 2008, 2(6): 525-528.
17 Park I H, Zhao R, West J A, et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature, 2008, 451:141-146.
18 Hanna J, Markoulaki S, Schorderet P, et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency.Cell, 2008, 133(2): 250-264.
19 Mikkelsen T S, Hanna J, Zhang X, et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysi. Nature, 2008,454(7200): 49-55.
20 Hyenjong H, Kazutoshi T, Tomoko I. Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway. Nature， 2009，460(7259):1132-1135.
21 Aasen T, Raya A, Barrero M J, et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat Biotechnol, 2008, 26: 1276-1284.
22 Marson A, Foreman R, Chevalier B, et al. Wnt signaling promotes reprogramming of somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell,2008, 3: 132-135.
23 MacArthur BD, Please CP, Oreffo ROC. Stochasticity and molecularmechanisms of induced p luripotency. Plos One, 2008,(3) : 1-11.
24 Mikkelsen TS, Hanna J, Zhang Xiaolan, et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature,2008, (454) : 49-55.