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中药在我国应用具有几千年的悠久历史,由于质量控制等问题,很难走出国门被国际认可。原因很简单：西药所含的化学成分、药剂中的含量等均准确,中药所含的化学成分却始终难以进行掌控，因此,质量标准化就成了中药跨出国门的最大障碍[1]。中药疗效是多种活性成分共同作用的结果,若仅对其中一种或几种成分加以质量控制,则难以全面衡量中药及其制剂的质量、疗效和稳定性。中药指纹图谱可以解决上述问题,目前已被美国、欧洲、印度、日本等国家广泛应用。2000年8月,国家药品监督管理局规定[2]，首先以建立中药注射剂指纹图谱为突破口,提高中药的质量标准水平,逐步实现中药材、中成药质量标准的现代化。因此,在有效成分不完全明确的前提下,制定中药材或中成药的特征指纹图谱,对于有效控制中药材或中成药的质量具有重要意义。
1 中药指纹图谱的定义、特点及属性
中药指纹图谱系指中药材或中药经适当处理后,采取一定的分析手段,得到能够标示该中药材或中成药特性的共有峰的图谱。中药指纹图谱的制定对于中药材 GAP基地建设、中药材种(SOP)、选择优良种植资源和药材道地性研究极为重要。而建立完整的中药原料指纹图谱及中药制剂指纹图谱,则可对中成药生产的全过程进行质量监控,对保障最终产品的质量稳定起重要作用。
中药指纹图谱具有如下特点[3]:(1)通过指纹图谱的特性,能有效鉴别样品的真伪或产地;(2)通过指纹图谱主要特征峰的含量或比例指定,能有效控制样品的质量,确保质量的相对稳定。
中药指纹图谱有两个基本属性[4]:整体性和模糊性。从指纹图谱的综合和整体性能看，它能够较准确且又可量化地对药材进行真伪鉴别和质量评价;而从细节上看，由于不可能获得所有化学成分的标样，并且还有很多化合物可能本身就是未知物，还难于给出准确的定量分析，对指纹图谱中的各个峰，并不要求其化学结构都清楚，也不需要对呈现在色谱图中的每个组分都清楚的定量，仅需要不同批号的同一药品的指纹图谱保持一致，所以，从这一角度来说，中药色谱指纹图谱又是模糊的。
2 中药指纹图谱研究的现状
目前指纹图谱已成为国内外公认的鉴别中药品种和评价中药质量的最有效手段。美国食品药品管理局(FDA)在 1996 年制定的 《FDA关于植物制品的指南(试行)》中,对植物制品补充品和植物药进行了规范和法制化。其中,对植物药品的临床化学、生产和控制部分,要求对植物原料、植物药中间品和植物药产品提供相应的指纹图谱(Fingerprint )。2000年,美国FDA允许草药保健品申报资料可以提供色谱指纹图鉴别资料[5]。《英国草药典》、《印度草药典》以及加拿大药用及芳香植物学会、德国药用植物学会也接受色谱指纹图谱。此外,WHO 在 1996年《草药评价指导原则》[6]中也有规定,在有关章节中都提到:“如果不可能鉴别有效成分,则鉴别一种或几种特征成分(如色谱指纹图谱)以保证制剂和产品质量的一致”。欧共体在草药质量指南的注释[7]中提到“草药的质量稳定性单靠测定已知的有效成分是不够的,因为草药及其制剂是以其整体作为有效物质。因此,应该通过色谱指纹图谱显示其所含的各种成分在草药及其制剂中是稳定的,其含量比例能保持恒定。例如欧山楂(花叶)的薄层色谱指纹图谱所显示的结果”。
目前,中国中医研究院中药所刚起步的指纹图谱标准规范化研究,从中药现代化的源头中药材着手,开始对黄芩、芍药、川芎、苍术等一批中药材进行检查、鉴别、含量测定等指纹图谱方面的基础性研究,从而建立起一套完整的对中药材质量全面综合的评估系统。中国国家药品监督管理部门也于 2000 年发布了 《中药注射剂的指纹图谱研究的技术要求(暂行)》,明确要求对新申报的中药注射剂和已上市的中药注射剂实行指纹图谱标准，在中药指纹图谱的实践应用中走出了第一步。
3 中药指纹图谱方法学
色谱法是分析化学领域中发展最快、应用最广的分析方法之一，也是中药指纹图谱最基本的技术，常用的色谱技术主要有柱色谱和平面色谱，其中包括液相色谱(LC)、气相色谱(GC)、薄层色谱(TLC)和毛细管电泳(CE)等。 各种色谱技术均有其自身的优点和不足，相互间可以取长补短，而选择何种色谱技术，具体应用时，取决于供试品的性质和工作的目的。现介绍如下。
3.1 高效液相色谱 (HPLC)指纹图谱 HPLC法由于具有分离效能高、分析速度快、适用范围广、流动相选择范围宽、灵敏度高、色谱柱可多次利用、流出组分可收集、重现性好等优点,目前已广为普及用于中药分析,是目前指纹图谱研究中使用最多的方法。采用多种检测器，可同时获取保留值信息和化合物的光谱、质谱等特征信息。二极管阵列可见-紫外分光检测器在色谱运行的任何位置实行全波段检测，使未知峰定性的可靠性大大提高。对组分复杂，指纹特征非细分不足以表达的样品，是非常有效的。与质谱仪联用，已成为混合物定性分析的最重要手段。由于现阶段还不能做到对每味中药和每种成分逐一鉴定,因此并不要求确定指纹图谱中每个峰对应组分的化学结构,也不需要对呈现在图谱中的每个组分都能定量,仅需尽可能多地反映中药全貌的指纹图谱,不同批号的同一种药品指纹图谱保持基本一致即可。通过不同特征峰来标示中药,基本上可反映出中药的化学成分及含量分布情况。
张蕾等[8]用高效液相色谱法测定青果丸中芍药苷的含量,方法简便,结果准确。瞿为民等[9]报道了人参、西洋参及三七指纹图谱。刘艳华等[10]进行了丹参的 HPLC指纹图谱研究。游松等[11]对银杏叶注射剂进行了指纹图谱研究。朱莲华等[12]采用 HPLC - FPS对不同产地何首乌的甲醇提取液和氯仿-甲醇提取液进行分析。周玉新等[13]以 HPLC梯度洗脱法对三七原药材、三七总皂苷提取物及三七总皂苷注射液进行了指纹图谱的研究,方法可操作性强、重复性好。
3.2 薄层色谱 (TLC)指纹图谱 TLC具有快速、经济、可靠、操作简单、适应范围广、直观性强、重现性较好等优点,为国内外学者接受和广为使用，应用于中药鉴别频率最高，至今仍是《中国药典》、《美国药典》、《印度草药典》、《欧洲药典》、德国医学委员会编辑的草药专著等普遍应用的鉴别手段。用固定波长对薄层展开的各斑点做薄层扫描的扫描图谱比目测的层析图谱更为客观准确,因而具有更好的指纹鉴别意义。在新药研制中,几乎所有的新药都必须提供薄层层析谱,并需附有标准品或对照药材、 阴性样品对照的彩色照片。在实际的薄层层析鉴别中,有时因中药的成分性质相近而难以分开时,还可采用高效薄层层析法(HPTLC),该方法是采用更细、 更匀的吸附剂,因而提高了分离效果,使斑点小而圆,重现性增强。同时,点样量还可减少到 0.1 μl以下,使原点直径控制在 1mm 内,展开时间缩短,展距缩小(3～7cm/10 ～15min),达到微量、快速和高效的目的。为使薄层层析的结果更为直观,可将经溶剂展开的薄层板置薄层扫描仪上做可见-紫外光测定或荧光测定。
薄层色谱的主要优点[14]是：(1)可在同板同时分析多达18个样品的色谱，时效高;(2)所用的是正相展开剂，其组成变化灵活多样，可适应多种成分的分离;(3)离线操作，既可直观比较图谱，又可上机扫描得到罗阔图和处理数据;(4)占机时间短;(5)最突出的优点 是比柱色谱多了色彩参数，得到的是色彩丰富的色谱图像，直观性强。
3.3 气相色谱 (GC)指纹图谱 气相色谱以气体为流动相,具有分离效能高,灵敏度高,用量少,分析速度快等优点,适合于植物的挥发油成分及其他易挥发性成分或可转化为可挥发的成分测定。对于一些具有挥发性成分的中药的鉴别,GC 能发挥独特的作用。气-质联用技术更增强了其定性功能,不仅能区分不同中药中挥发性成分的差别,还可阐明被检成分的结构。GC和 GC/MS 用于中药指纹图谱研究时,含挥发性成分中药取样的代表性、合理性对实验结果的稳定性影响尤为显著。高阳等[15]以贵州省斑蝥药材为分析对象建立斑蝥药材 GC指纹图谱,研究表明,建立的 GC指纹图谱有良好的重现性;不同产地的斑蝥药材共有峰相对峰面积有一定的差异,为斑蝥药材质量评价提供可靠的依据。
3.4 高效毛细管电泳 (HPCE)指纹图谱 毛细管电泳技术近几年发展非常迅速，并在医药、生物分析及生命科学等领域有广阔的应用前景。本法具有分离模式多、分离效率高、速度快、使用范围广、所需样品量和试剂量少、可直接分析水溶液等特点。高压电泳使它具有高效率、高分辨率等优点，结合与之适应的紫外、荧光、点化学、质谱、拉曼光谱等多种检测器而被应用于离子型药物分子、生物分子的分析、DNA序列以及DNA合成中产物纯度的测定等。目前已有一些研究应用的报告，如用 HPCE建立的冬虫夏草指纹图谱[16]可用于其真伪优劣的鉴别，虽然尚不普及，但是一种很有前景的色谱技术。
3.5 高速逆流色谱(HSCCC)技术 HSCCC是当前国际上较新型的液-液分配技术。该技术利用相对移动的互不相溶的两相溶剂，在处于动态平衡的两相中将具有不同分配比的样品组分离。它不是用同相载体作固定相克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染、峰形拖尾等缺点。目前国内HSCCC技术在中草药分离分析方面的应用还处在起步阶段，但这方面的应用前景是广阔的，管淑玉等[17]采用高速逆流色谱法进一步分离何首乌中二苯乙烯苷，方法简便，技术可行。
4 中药指纹图谱应用的局限性问题
4.1 中药材本身质量的控制问题 由于植物药的次生代谢产物随外界环境会发生很大的变化，它的化学指纹图谱也就具有无法精密度量的模糊性[18]。相同品种中药样品间所存在的个体差异在其内在特性上也将会有所反映，这些差异必然会导致色谱图的差异，因而色谱图强调的是色谱的整体面貌而不是精确的细微差别，反映的信息是综合的结果。表现在化学指纹图谱上也就不是对单一的化学成分定性、定量，而是对某一类成分的整体谱图特征的展现。而怎样在众多潜在不稳定因素存在的情况下测得稳定的指纹图谱又是我们要解决的首要难题。在谱图分析中，以色谱图直接作为鉴别依据的模式识别方法中，它借助于现代电脑技术对各谱图进行比较，据此说明各谱图间的相似性和差异性。虽然以图谱比较而言，它具有简单而直观的优点，但它无法面对各样品的个体差异所导致的不同，因此不仅要抓住品种的特征，同时又要模糊那些个体特征，获得客观公正的鉴定是十分必要的。如文献[19]中所列不同产地肉桂谱图形态的比较。
4.2 对指纹图谱应用领域理解上的局限性[20] 目前,对指纹图谱的应用研究多数集中在两个方面,一是利用其所提供的信息对中药材进行区分、鉴定;二是研究如何评价图谱之间的相似程度,以便于将来根据标准指纹谱评价待检样品的质量。这在一定程度上限制了指纹图谱的应用范围。实际上,在大量实践的基础上通过确定的生产工艺流程和确定的测试方法得到的指纹图谱,不应仅限于最终产品质量评价和真伪判别这一目的,在确定所得指纹谱确定、专属的前提下,指纹谱不仅可用于最终产品的质量控制,还可用来对生产过程进行控制。我们不需要知道工艺的每个步骤,试验的每个操作得到的指纹谱包含的信息是什么(当然,能够明确指纹谱提供的信息更有利于对其进行控制),但我们能以指纹谱的“相似性”对其作出评价:根据各生产环节指纹图谱的变化情况可以考察操作条件对产品质量的影响程度及产品质量影响较大和影响较小的因素(或过程),从而确定工艺参数的合理范围及重要工段。其次,根据对生产过程的指纹图谱的分析结果,对生产过程实现自动控制。
4.3 色谱法本身的缺陷性 中药指纹图谱一般说来是以HPLC指纹图谱为最基本的方案，同时联用技术是目前最受重视的手段。色谱图中色谱峰的定位受许多因素的影响[21]。一般均用色谱峰的保留值定位，虽然色谱实验条件是控制保留值的首要因素，但尚有许多非色谱技术所致因素。《中国药典》[22]附录规定了高效液相色谱法对仪器的要求，除固定相种类、流动相成分、检测器类型不得任意改变外，色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分比例、柱温、进样量、检测器灵敏度等均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适应性试验要求，即只要能满足待测成分能达到含量测定的要求即可，其他成分是否分开或者停滞在色谱柱中无关紧要。而作为中药及其制剂色谱指纹图谱，这样的变动却可能在生产检测、新药审批、药检系统检验、市场质量监督的实际执行中带来难以预料的后果，因为色谱条件的任何改变，都意味着整体色谱图形的变异[23]。
4.4 指纹图谱的解析 指纹图谱的解析也是研究中的一大难点，常用的直观比较分析虽然方便但缺点较多，以色谱指纹图谱为例：首先，对两张色谱指纹图谱仅靠人的主观比较来判断它们的相同、相似或不同，往往由于人为的主观误差而做出不同的判断，缺乏评判的客观标准[24]。在目前对指纹谱分析及其应用中,虽然运用了各种数学方法来分析谱图数据,但计算中大多引用的是二次数据,也就是说,引用的是经过仪器配套软件处理过的数据,或是研究者处理后的数据 ，甚至引入了其他参数,而不是测试所得的原始数据。虽然分析中采用二次数据更为简便、更易进行,但却失去了指纹图谱“原始概貌”,对分析结果的客观性有一定影响。其实对于中药(材)质量评价和分类研究而言,其指纹图谱的原始数据就是对样本所含特征的全面、间接或直接的体现,直接用原始数据进行评价分析应比二次处理后的数据更为可靠。
5 中药指纹图谱的发展前景
作为一个能够实际应用于中药的过程控制及质量评价的判断标准,现阶段的指纹图谱在理论和实践上都远没有成熟起来,还需要做大量的工作。鉴于天然植物药材很难避免的个体差异,会导致指纹图谱某些方面的变化,这中间存在着一个质量标准管理的问题。目前,《美国药典》不接受指纹图谱,我国专家也建议在国内先建立能用于实际工作的企业标准指纹图谱,暂不上药典。当然,中药指纹图谱的发展前景是非常看好的。
中药化学成分复杂多样,指纹图谱的发展要依靠分析技术的发展和创新,多维多息谱的发展将成为研究的热点。建立多维多息特征谱的最大优点在于能较系统、较完整地解决中药注射剂面临的保证药效和质量的难题，另一优点在于为解决中药研究中缺乏标准品的难题提供一条可行之路。新仪器、新方法大大促进中药指纹图谱的发展,从而使之更加成熟,图谱分析更加准确。
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