携带可调控人前脑啡肽原基因逆转录病毒载体的构建及鉴定

2005年12月28日 中华麻醉学杂志 2005 Vol.25 No.7 P.511-514 11 （武汉）为了构建四环素调控的含人前脑啡肽原基因(hPPE)逆转录病毒载体。研究者用PCR方法扩增目的基因hPPE，定向克隆入逆转录病毒四环素反应质粒(pRevTRE)中，酶切反应、PCR及DNA测序鉴定重组逆转录病毒载体pRevTRE/hPPE,在脂质体介导下分别将pRevTRE/hPPE和逆转录病毒四环素调节质粒(pRevTet-on)转入包装细胞PT67，经相应的抗生素稳定筛选得到抗性细胞克隆。RT-PCR鉴定得到阳性产病毒细胞系PT67/Tet-on和PT67/TREhPPE.用NIH3T3细胞测定病毒滴度。结果经限制性酶切分析、RT-PCR及DNA序列分析证实pRevTRE/hPPE中含有hPPE基因。转染有pRevTet-on的PT67细胞病毒滴度为2.6×105CFU/ml，转染有pRevTRE/hPPE的PT67细胞病毒滴度为3.2×105 CFU/ml。可见成功构建了含有受四环素调控hPPE基因的逆转录病毒载体，建立了能产较高滴度逆转录病毒的包装细胞系，为可调控细胞移植镇痛的研究奠定了实验基础。