来自中国科学院海洋研究所,福建省高校水产科学技术与
食品安全重点实验室的研究人员探讨了Pharmacia公司的一种用于
遗传分析的DNA标记物(marker)的发展,并利用这套标记物和自己开发的标记物识别软件,构建了一套基于MegaBACE 1000 DNA测序仪的改良的、高通量的AFLP操作流程。
MegaBACETM 1000 DNA测序仪是由美国Pharmacia公司生产的一种高通量的DNA测序仪,利用这套测序仪,可以进行DNA测序、遗传分析等相关研究。
这一仪器采用96通道毛细管电泳系统,具有高通量和自动化程度高等特点,在质粒和PCR产物质量保证的前提下,测序长度可在500-1000碱基之间。该测序系统广泛应用于基因组、功能基因组、EST、遗传分析、遗传图谱构建、基因芯片制备前所需的大规模DNA序列分析等领域,但但该公司生产的用于遗传分析的DNA标记物(marker)(ET550-R Size Standards)价格不菲。
出于节省成本的考虑,在这篇文章中,研究人员自行开发了荧光标记物,经过验证,这个标记完全可以在MegaBACE 1000 DNA测序仪上使用。利用这套标记物和自己开发的标记物识别软件,构建了一套基于MegaBACE 1000 DNA测序仪的改良的、高通量的AFLP操作流程。
研究人员的基本思路是:采用不同的质粒(其中含有长短不一的插入片段),选用带有荧光标记的引物进行PCR扩增(其中的两个PCR产物需进行酶切),这样就可以得到从几十个碱基到几百个碱基的片段,混合之后就可以当作标记物使用。使用这种标记物和自己开发的标记物识别软件,我们建立一个改良的、高通量AFLP程序。
研究人员表示,他们的下一步计划是合成具有能量转移盒子标记的引物,相对于MegaBACE公司生产的标记物,我们利用tamar染料标记的引物激发的荧光强度不是很高,这与MegaBACETM 1000 DNA仪器有关。该仪器的蓝色激光头发射的波长为488nm,而Tmamra的最大吸收波长为560nm,激发波长和吸收波长相差较远,因而,Tmamra激发强度不高。Pharmacia公司生产的ET550-R Size Standards是用两种荧光,FAM和ROX,两者之间仅隔10碱基对,蓝色激光头发射的波长与FAM的最大吸收波长494nm十分接近,FAM获取能量用来激发ROX,因此能够激发较高的荧光强度。如果能够将FAM和Tmamra这两种染料整合到一起,那么标记出来的引物将具有更大的荧光强度,从而使标记物的用量减少,成本降低。
作者:
2010-1-12