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核酶对人肝癌细胞多药耐药性的逆转

来源:慧聪网
摘要:[摘要]目的利用核酶技术切割肿瘤多药耐药基因(MDRl),逆转肿瘤抗药性。方法按照锤头结构模型设计、合成了核酶196MDRl(196RZ),并定向克隆人包含RNA多聚酶Ⅲ启动子的逆转录病毒载体中。通过脂质体介导,将抗mdrl核酶表达质粒(N2A+tRNAmet-iMDRl-Rz)导入人肝癌耐药细胞株HepG2。分别采用RT-PCR、荧光PCR、蛋白质印迹分析(w......

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        [摘要]    目的    利用核酶技术切割肿瘤多药耐药基因(MDRl),逆转肿瘤抗药性。方法    按照锤头结构模型设计、合成了核酶196MDRl(196  RZ),并定向克隆人包含RNA多聚酶Ⅲ启动子的逆转录病毒载体中。通过脂质体介导,将抗mdrl核酶表达质粒(N2A+tRNAmet-iMDRl-Rz)导入人肝癌耐药细胞株HepG2。分别采用RT-PCR、荧光PCR、蛋白质印迹分析(western  blot)、流式细胞仪检测术、罗丹明聚集及MTT方法,观察细胞的RZ、mdrl  mRNA、P糖蛋白(Pgp)表达和对化疗药物敏感性的变化。结果    经抗MDRl核酶处理的耐药HepG2细胞,RZ稳定表达,MDRl  mRNA、Pgp明显降低,细胞内罗丹明聚集,对阿霉素的敏感性提高200倍。结论    针对多药耐药基因mdrl的核酶可明显降解mdrl  mRNA,抑制Pgp的表达,具有强大的逆转肝癌耐药细胞HepG2多药耐药的作用。

        [关键词]    肝肿瘤;P-糖蛋白;多药耐药性

        肝癌的多药耐药性(multidrug  resistance,MDR)严重影响着肝癌的化疗效果和预后。而传统的MDR逆转剂是作用在P糖蛋白(pglycoprotein,Pgp)水平,效率低,副作用大。核酶(ribozyme,RZ)是可作用于靶mRNA的具有催化活性的RNA,Ayre等[1]提出了锤头结构模型并利用锤头状核酶在体外或细胞内特异性切割mRNA,阻断基因的表达。随着分子生物学发展,尤其是对核酶的研究为肝癌MDR的逆转提供了新的策略。核酶通过碱基配对,特异地与靶mRNA结合,并切割分解靶mRNA。其突出的高效率、高特异性、少副作用,被誉为分子剪刀,为从基因水平逆转MDR展示了良好的前景。本研究旨在探讨用这一先进技术来逆转MDR的可能性。

        材料与方法

        1.细胞模型的建立:人肝癌耐药细胞系HepC2,由华中科技大学同济医学院肝脏外科中心实验室建株。在37℃、5%CO2条件下,以含10%小牛血清、青霉素(100  U/ml)、链霉素(100  μg/ml)的RPMI1640培养液中进行细胞培养和传代。

        2.核酶的构建和克隆人载体:核酶质粒由日本Hiroyuki  Kobayashi博士惠赠。用限制性内切酶BamHI  and  StuI,将包含△3′-5′mutant  humantRNAimet,基因的500  bp的DNA片段从phH2D△3′-5′质粒中抽提出来,并将之克隆人含3′长末端重复的N2A载体上的SnaBI位点。设计为N2A+tRNAimet构建质粒N2A+tRNAimet-iMDRl-Rz,通过转染大肠杆菌DH5α纯化抽提质粒(Promaga,质粒抽提试剂盒),转染GP+envAMl2细胞用以病毒包装。

        3.HepG2细胞的转染和筛选:取6孔培养板,每孔接种约8×104**HepG2细胞,细胞生长汇合达70%时开始转染。质粒DNA20μg,脂质体10μl,孵育时间6  h。分别设置转染组(A组)和未转染组(B组)。待转染细胞生长72  h后,细胞接近融合时,按1:3密度传代;继续培养至细胞密度达80%融合时,加浓度为80μg/ml的G418培养液进行筛选,以未转染的细胞做筛选对照。当对照细胞绝大部分死亡时,再更换一次转染细胞的筛选培养液(浓度为800  μg/ml),2d后,将G418浓度降至400μg/ml维持筛选;3周后可见抗性克隆形成,消化收集克隆后继续培养待测各种指标。

        4.RT-PCR检测MDRl    mRNA表达:采用TRIZOL试剂提取细胞总RNA,-70℃保存备用。除特别标明的试剂外,均使用Promega公司的RT/PCR试剂盒。以MJ公司PTCl00型PCR仪作热循环:预变性94℃2  min;循环:94℃30s、57℃  45s、72℃  60s,共35个循环。循环后延伸72℃  5  min。PCR后,以2%琼脂凝胶电泳检测扩增结果;GDS8000型凝胶成像分析系统对目的DNA条带扫描,确定其光密度值,将MDRl与β-actin比值作为MDRl表达水平的参数,对MDRl产物相对定量。MDRl与β-actin的引物设计参照基因库,运用引物设计软件自行设计。

        5.定量RT-PCR:(1)仪器:美国ABI  PRISM7700扩增仪;上海久盛公司提供ABI  PRISM  7700微量荧光检测仪及数据处理软件。(2)试剂:由上海久盛公司提供DNA荧光定量试剂盒。(3)方法:遵照仪器及试剂盒使用说明进行样本检测。引物及探针设计根据基因库,运用引物设计软件自行设计。斑点杂交法报告阴、阳性结果;FG  PCR以N+4/5(P1N)为判断标准(N为空白对照之荧光强度,Pl为102COPY/ml阳性质控品之荧光强度),样品荧光强度小于该标准为阴性,大于该标准为阳性,并通过曲线获得DNA含量。

        6.蛋白质印迹分析:收集细胞以冷PBS清洗2次,以裂解缓冲液[50  mmoL/L  Tris  cl(pH=8.0),120  mmol/L    NaCl,0.2    mmol/L    EDTA,1  mmol/LPMSF和1%NP40]提取总蛋白,取150μg总蛋白上样进行SDS  PAGE电泳,通过电转移法将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素滤膜上,氨基黑染色30s,10%乙酸脱色。加入封闭缓冲液室温振荡1  h,将膜放入溶有鼠抗人Pgp、MRP、LRP蛋白单克隆抗体(1:1000稀释)的新鲜配制封闭液4℃下振荡2h,漂洗后滴加羊抗鼠IgG,ECL曝光显色。

        7.细胞对R123的蓄积作用和外排测定:l×109/L单细胞悬液,加入2.5  mg/L的荧光染料R123,37℃  CO2培养箱中培养45  min后,用PBS漂洗2次(1500r/min,3min),取250μl用作R123蓄积测定,试管内余液加培养液,37℃培养45  min,取250μl作外排测定,在λex=488  nm、λem=525  nm处测定R123荧光强度,每个样品测定约104个细胞。

        8.细胞药敏试验(MTT试验):将细胞数调整至3×104/ml,取96孔板,每孔加入200μl细胞悬液,培养箱中过夜;去掉培养液,加入用1640配制的不同浓度的阿霉素溶液(每m;分别含0.00001μg,0.0001  μg,0.001  μg,0.0l  μg,0.1  μg,l  μg,10  μg,100μg),200μl/孔,细胞培养箱中48  h后,每孔加入MTl20  μl(10mg/ml),保温4h。弃上清,加入二甲亚砜200  μl/孔,酶标仪上测出550  nm值,算出ID50并做图。

        9.激光共聚焦检测核酶转染细胞的凋亡:收集细胞,PBS漂洗2-3次,生理盐水调整细胞密度为l×lO/ml的细胞悬液,将细胞涂于预先涂有多聚赖氨酸的载玻片上,吹干,用新配制的40g/L多聚甲醛室温下固定30  min,宝灵曼公司生产的细胞凋亡原位检测试剂盒进行检测,Bio-RadMRC-1024激光共聚焦显微镜观察,每张玻片选取3个视野进行荧光强度的定量分析,结果以灰度值表示。

        10.统计学方法:实验结果采用方差分析和相关分析。

        结果

        1.耐药HepG2细胞系和HepG2-iMDRl-sRz细胞系的MDR特性:两细胞系经20h倍增后,姬姆萨染色,显微镜下观察,与母系HepG2细胞相比未发现有形态学的改变。RT-PCR检测HepG2-iMDR1-sRz细胞系,能稳定表达RZ,扩增片段120bp。耐药HepG2细胞MDRl/Pgp大量表达;HepG2-iMDRl-sR2细胞系MDRl/Pgp表达则明显减少。

        2.药敏试验:HepG2-iMDR1-s  Rz细胞系对长春新碱、阿霉素的药物敏感性完全恢复。核酶能完全逆转肝癌耐药细胞的耐药性。

        3.  PgP功能测试(罗丹明试验):罗丹明流式细胞术结果提示,HepG2-iMDR1-s  RZ细胞系细胞荧光强度显著高于耐药HepG2细胞系细胞。罗丹明是Pgp的特异性荧光底物,能被Pgp从细胞内泵出,HepG2-iMDRl-s  Rz细胞由于PgP的含量减少,排出罗丹明的功能下降,细胞内罗丹明聚积,故荧光强度明显高于耐药HepG2细胞系细胞。

        4.激光共聚焦检测细胞凋亡:阿霉素诱导的HepG2细胞,转染iMDRl-sR2后,出现染色体边集,核碎裂,出现凋亡小体。

        MDR的发生机制较多,目前认为Pgp是形成MDR的最主要机制[2,3]。因此,有关MDR的逆转录研究也主要集中于对这一机制上。研究者们曾试图用药物来逆转MDR,非细胞抑制剂量的异博定(verapemil,VPL)能明显降低肿瘤细胞对长春新碱(vincristine,VCR)的耐药性[4,5]。尽管很多药物都有不同程度的逆转MDR作用,但是这些药物均只是在较高浓度条件下才能发挥作用,由于毒副作用,临床上不可能达到如此高的血药浓度,使应用药物逆转MDR受到限制。

        近年来,锤头状核酶用于基因治疗已取得很大进展,特别是在成功抑制HIV-1、bcl-abl、c-erbB-2、c-ras-1、p23H表达研究中的成果更是让人们对基因治疗的前景充满信心。核酶用于MDR的逆转研究近年来才有报道,Kobayashi等[6,7]合成两个核酶基因,分别切割MDRl  mRNAl96位和179位密码子,将切割MDRl  mRNAl96位密码子的核酶构建于pHβAPrlneo载体上,电穿孔法导人到耐药的人急性淋巴母细胞白血病细胞系MOLT3/TMQ800中,转染核酶后MOLT3/TMQ800对VCR的耐药性由原来的700倍(与其母细胞MOLT3比较)下降至20-30倍。在耐药的胰腺癌细胞系应用核酶逆转MDR,耐药性更是由原来的1600倍下降至5.3倍。研究显示,核酶逆转MDR的效率其催化切割位点最为重要,另外,载体途径和核酶与细胞浓度比也非常关键。有效的载体途径可以将核酶转入耐药细胞,高浓度的核酶可以在细胞内达到有效浓度,从而使逆转效果更加彻底。

        我们使用N2A病毒载体包装tRNAimet-iMDRl-Rz,构建质粒N2A+tRNAimet-iMDRl-Rz,纯化扩增后转入耐药HepG2细胞系,该196切割位点的核酶能完全恢复化疗敏感性。RT-PCR结果显示:RZ稳定表达于耐药HepG2细胞,real-time  RT-PCR和Western  Blot显示转染后的耐药细胞MDRl/Pgp表达较耐药HepG2细胞明显减少,Rhodamine试验也显示RZ转染后的HepG2细胞Pgp的量和功能均明显降低。MTF试验除了恢复阿霉素的敏感性,同时可以恢复长春新碱等化疗药的敏感性。

        显微镜下观察发现,与母系HepG2细胞相比,耐药HepG2细胞的生物学特性没有发生明显改变,其细胞数量和倍增时间未见明显变化。同样,核酶转染后的耐药HepG2细胞其生物学特性也未发现有明显改变。但有趣的是,在转染后的耐药细胞,激光共聚焦却发现许多细胞凋亡增加,其具体的机制有待于进一步研究。

        另外,核酶逆转HepG2细胞后,尽管可以完全恢复化疗的敏感性,但核酶并没有完全抑制MDRl/PgP的表达,考虑转入核酶与MDRl  mRNA比例不平衡及细胞内MDRl  mRNA二、三级结构的变化影响核酶与靶RNA的结合,导致核酶活性下降。也可能与其他未知因素有关。

        总之,利用特异性切割位点的核酶抑制肿瘤细胞MDRl/Pgp的表达逆转MDR,为进一步深入进行动物体内实验逆转MDR和临床MDR逆转提供了有价值的探索。
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