酶活性测定条件的选择和限定

依据上表一般都认为酶测定时底物浓度最好为Km的20倍乃至100倍。在实际工作中考虑到底物溶解度的限制，价格的昂贵，可将底物浓度降为Km的10倍。再低就不适合酶的测定，可能产生较大的误差。

以上规律适用于大多数酶。一些酶还有其特殊情况，常能遇到的是当底物浓度增加到一定范围后，酶反应速度不仅不增加，反而下降。如乳酸脱氢酶，当丙酮酸浓度超过一定量时，酶活性反而下降，故丙酮酸浓度不能过高。

以上介绍的米-门方程式只适用于单一底物的酶，不少酶催化反应二底物乃至更多底物，有关二底物的米-门方程式以及此时底物浓度的选择可参考一些有关书籍。实际工作中最简单的作法是先将其中底物之一的浓度选得很高，使酶饱和，然后求出另一底物的表观Km，反之亦然，最后按上述规律决定酶测定二底物的合适浓度。

（二）辅因子、活化剂的种类和浓度

从广义上说，凡能促进酶及反应物进入活化状态从而加速酶催化反应的物质都能称为辅因子，它包括种类很广的物质。英汉生化词典将辅因子（cofactors）定义为“一种酶的活性所需要的一种非蛋白质成分”。这种辅因子可能是一种金属离子激活剂或一种有机分子（辅酶）。它们或松或紧地与酶相结合；紧密接合的辅因子称为“辅基”。将激活剂（activator）定义为“一种金属离子，作为一种酶的辅助因子”。

在前面已谈到，测酶活性浓度时应该在最适条件下测酶反应的最大速度。如测定酶需要辅因子，活化剂时，应选择合适的种类和浓度加入到测定酶的体系中，在此过程中可能会涉及到下列四类物质。

首先是辅酶（Coenzyme）。很多酶反应都必须有辅酶参加。如相当部分的还原酶需要辅酶I（NAD⁺）和辅酶Ⅱ（NADP⁺）参加。

第二是辅基，辅基虽也是小的有机化合物，但却是酶蛋白不可分割部分，不含辅基的酶蛋白称为脱辅基酶蛋白，没有催化活性，必须加入足量辅基，和它结合成为全酶，才可能有催化活性。辅基显著特点之一是与酶结合需要一定时间，因此在酶测定时，如按底物一样来处理辅基，在酶反应开始时才加入辅基，则开始阶段反应较慢，经过一段延滞期后，反应才达到应有速度，因此在酶测定时，往往是先加入足量辅基，作用一定时间如10分钟后，再加入底物开始酶反应。

第三类是离子，很多酶需要特定离子帮助才能使其反应达到最大速度，最常见的是二价金属离子如Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺等。所有转移磷酸的酶，如激酶类和碱性磷酸酶的反应都需要Mg²⁺的参加。所以如在反应体系中加入金属螯合剂如乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)或以他们为抗凝剂常抑制一些酶的活性。因此酶测定的标本多采用血清而不采用血浆，此外还有单价的K⁺。如丙酮酸激酶反应同时需要K⁺和Mg²⁺。淀粉酶催化的反应需要阴离子Cl^-，5mmol/L氯离子可加速淀粉酶的反应三倍。

离子加速酶反应的机制是多种多样，Zn²⁺是碱性磷酸酶和羧基肽酶A整体结构的一部分，可稳定酶的三级和四级结构。Cl^-加速淀粉酶反应的机制可能与它能与酶分子中某些带了阳电荷基团结合有关，改变了在催化作用中起重要作用的基团的电离常数，有些离子可使酶分子带阳电荷，和带阴性电荷的底物结合，在酶反应中起了桥梁作用。必须注意的是，过量的离子往往抑制酶反应速度，在测定酶时要选择合适的浓度。

第四类是一些无法包括在前三类的其它加速酶反应物质，如巯基化合物可稳定酶的双硫键。还有所谓的表观激活作用，该物质并不是真正加快反应速度，而是由于和抑制剂作用抵消了抑制作用，从表面上看似乎是加速了酶的反应作用。

（三）选变构剂的种类和浓度

有一类特殊的酶叫变构酶（allosteric enzyme），其反应速度和底物关系不同于一般酶的双曲线，而出现S形曲线，这是由于这种酶具有二个或更多个独特的部位——或是相互作用的催化部位与调节部位，其结果是酶与底物作用速度将受另一类物质的影响，这类物质命名为变构剂或效应物。根据作用不同又分为变构激活剂和变构抑制剂或者正负效应物，而不同浓度的变构剂会明显改变曲线形状。变构酶在物质代谢中有重要的调节作用。在测定变构酶活性浓度时，必须选择好变构剂种类和浓度。一般来说应选择在饱和浓度的变构剂的条件下测变构酶的活性浓度。

二、指示酶与辅助酶的种类和浓度

（一）指示酶、辅助酶的种类

常规化验中常用的酶偶联法中，多以脱氢酶为指示酶，在常规化验中的自动分析仪几乎无一例外都有340nm波长，通过NAD(P)H系统可以很方便地监测到指示酶反应。但从理论上说，往往可以有不止一种偶联方法，只要设法使偶联反应中最后一个是指示酶反应，前面已提到测CK可以正向逆向二个方向建立二种不同酶偶联的反应，速率法测定ALT的偶联反应式如图8-18所示。

在丙氨酸转氨基酶（ALT）测定法中，正向反应后产生丙酮酸和谷氨

图8-18 速率法测定ALT的偶联反应式

酶，目前最常用的是乳酸脱氢酶与丙酮酸偶联反应，伴有NADH下降。但也可以用谷氨酸脱氢酶与谷氨酸作用，伴有NADH生成。总之，酶偶联法为实验室工作开辟了一个广阔前景。在设计和选择测定酶活性浓度方法时，应该创造更新的方法，而不应拘泥于书本上的方法。

在选择时首先应考虑其特异性。其次应考虑酶偶联反应的合理性，如能直接与指示酶偶联，就没有必要加入辅助酶。所选用的指示酶，辅助酶除了应选Km小的酶（这样容易使它们催化反应速度大大超过测定酶反应速度），还必须考虑指示酶，辅助酶是在测定酶的“最适条件”下工作，此时往往不是指示酶、辅助酶的最适条件，如二者差异太大不利于整个酶系统的反应，例如乳酸脱氢酶最适pH为7.4，而丙氨酸氨基转移酶最适pH也是7.4，乳酸脱氢作为指示酶比谷氨酸脱氢酶更为合适，因后者最pH为8.4。如最后制成试剂盒，则还需从经济角度选择一些价廉物美，又易取材、纯化得到的酶制剂。

（二）指示酶、辅助酶的浓度

选择适量的指示酶和辅助酶，使酶偶联反应中间产物低，延滞期短，而且经济合算，这的方法主要有以下几种。

1.最简单的方法是根据Vx/(Km)x=Vi/(Km)i的比值来选择指示酶的用量Vi，式中Vx为测定酶的测定上限，(Km)x和(Km)i分别是测定酶和指示酶的米氏常数，有人计算过当比值为1:100时，测定值低4%；如改为1:10时，指示酶的反应速度将比测定酶反应速度慢28%，如增加到1:1000，则误差只有0.7%。这是因为,当我们用酶偶联反应体系测酶活性浓度时，测定酶的反应必须是体系中的限速反应，工具酶所催化的最大反应速度必须远远大于测定酶，由于工具酶所催化的反应必须在中间产物浓度很低条件下进行，并且将其很快转变为最终产物，反应体系中不应有中间产物堆积，否则将导致误差。

2.可以根据米氏方程式来计算，在酶偶联反应中，指示酶催化速度（Vi）的米氏方程式为：

3.在酶偶联反应体系中，不可避免会出现延滞期，在测定酶时希望此延滞期愈短愈好，此时可利用Mcclure介绍的计算法计算出一定延滞期时所需指示酶的量。

Mcclure假定在下在酶偶联反应中：

第一个反应为零级反应，第二个反应为一级反应，且中间产物B浓度远小于指示酶的Km，即B<<(Km)i.

通过推导，积分，最后可得公式：

例如在CK测定中，指示酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶Km为0.11mmol/L，我们希望延滞时间为1分钟，则指示酶用量为：

＝0.51mmol min-1L-1＝510 U/L

总之，从上式可清楚看到，延滞时间t与指示酶的Km成正比例，与用量成反比。
 

三、反应体系的最适pH、缓冲液的种类和浓度

（一）最适pH

固定酶反应的其它条件，在不同pH处测定酶反应速度，可得各种类型的酶活性与pH关系如图8-19所示。

最常见的是(a)的对称钟形曲线，少数的如(b)(c)在一侧即偏酸或偏碱处活

图8-19 酶活性与pH的函数关系曲线可能具有的几种形状

性最高。生化学家将酶活性最高处的pH称为最适pH。一般来说，血清中大多数酶最适pH接近中性（pH6.5～7.5）。有些酶在最适pH处活性变化类锐明显，也有些平坦宽广。测定酶活性浓度时一定要选择在最适pH处，不仅因为此处酶反应速度最大，测定灵敏度最高，还因为此处酶活性变化的斜率最小，如反应体系中出现pH变化时，对测定结果影响最小。pH对酶还有一个重要的作用，就是影响酶的稳定性。

pH值对酶活性及稳定性的作用的有关实验结果得出的钟形曲线，如图8-20所示。

图中曲线A是最适pH值实验的结果，出现典型的钟形曲线。其最适pH为6.8，高于或低于6.8时，酶反应速度下降，下降的原因可能与上述诸因素有关，但也可能由于酶稳定性下降失活所致，或者是二者原因之总和。通过曲线B的实验，可将上述二类原因分清。此时先将酶与不同pH底物缓冲液温育一段时间，此时间一

图8-20 pH对酶活性及稳定性的作用

般与测定时间相当，然后再将pH调回最适pH处测其活性。从曲线B可以说在pH 5～6.8以及pH 6.8～8.0之间酶活性的下降与酶灭活关系不大，酶在最适pH处储存常较稳定。但有些酶贮存在最适pH时，并不一定比在其它pH处更稳定。最适pH并非是酶的特征性常数，易受多种因素影响而改变，如缓冲液的种类、底物浓度、温度及酶浓度高低等，还应注意试剂中各种防腐剂和其它添加剂的影响。

最后必须强调的是本节讨论的pH并不是指底物缓冲液的pH，而是底物和标本混合后的pH对反应速度的影响，由于实验室所测的标本很少是纯酶样品，多为体液或组织粗提液。它们也是有一定pH值和缓冲能力的缓冲液，和底物缓冲液混合后，不一定维持住原来pH，特别是当二溶液的pH相差甚远时，变化更大。从而影响酶测定结果。有人认为血清放置过长，由于CO2逸出引起血清pH偏碱。
 

（二）缓冲液的种类和浓度

过去长期以来，认为缓冲液的作用就是维持酶反应的最适pH，忽视了缓冲物质对酶反应的其它作用和影响，Howell等研究了酶活性在三种不同缓冲液的变化情况。各种缓冲液的温度及pH的关系如图8-21所示。

三种不同缓冲液不仅最适pH不一样，最大反应速度也有差异，从图中可以看出选用磷酸盐与L-Asp和L-Ala的混合缓冲液最佳，因为它的pH值受温度影响较小。类似现象在大多数酶都能

图8-21 各种缓冲液的温度及pH的关系

观察到，仅是程度不同，其中以碱性磷酸酶活性受到缓冲液种类影响最为显著，在二乙醇胺缓冲液所测酶活性约比在碳酸盐缓冲液所测的高2倍。

由于缓冲液含有大量离子，或影响酶蛋白的构型，或影响底物的解离程度等等，从而影响酶活性。因此在方法设计时，选完缓冲物质后，还必须了解不同浓度缓冲液对酶活性的影响。一般而言，随缓冲液浓度增加，电解质干扰酶和底物结合，酶活性将逐步下降，所以选择缓冲液浓度时，常需在浓度较高以保持足够缓冲能力和浓度较低以免抑制酶活性两个相矛盾作用之间取得平衡。

在目前酶测定常用的一大类所谓生物缓冲物质，如图中的三羟甲胺基甲烷(trishydroxymethylamino-methane,Tris)、三乙醇胺受温度影响较大。因此在我国学会文件中指出“配制缓冲液时不仅要指出其pH值，还应说明配制温度，以避免因温度不同而引起的误差。”在此图中还可看到，即使是同一种缓冲液，随其它物质存在，也有可能改变温度的影响。因此在实际配制缓冲液时，应首先将配制溶液温度调节到规定温度，然后在pH计监测下加入相应的酸或碱将溶液pH调到要求范围。不控制温度，不用pH计盲目按一些书提供的量配制缓冲液是不可取的。

四、其它影响酶活性因素

除了上述主要因素外，一些其它因素也会影响酶活性，如反应体系中含有氧化剂，可氧化酶蛋白中甲硫氨酸、色氨酸和酪氨酸残基，使酶失活，试剂盒中常用的一些表面活性剂如Tween-80、Brig-35等会抑制一些酶的活性。

其它因素中，对酶测定而言，最重要的是抑制剂的作用，抑制作用是酶学中的一个重要研究内容。但如只涉及到设计和选择测定酶的方法，则比较简单，既然要测定的是“最适条件”下的最大反应速度，那么不论是可逆抑制剂，也不论是竞争性、非竞争性、反竞争性抑制剂都应在反应体系中设法除去。此问题在测定尿液中的酶时尤为突出。在病理情况下尤其使用各种药物后，使情况更为复杂，此时尿中可出现不少正常情况下不出现物质，即可能抑制酶活性，也可能激活酶活性。为使脲酶测定结果有一点可比性，最好在测定脲酶前，通过透析、凝胶层析或超滤将小分子化合物与酶分开，这样较为可靠。

五、温度的控制

要了解此问题，应注意温度对酶活性影响的双重性。首先，化学速度随温度升高而加快，酶反应也不例外。Q10值即温度增加10℃，化学速度的变化率。酶的Q10值约在1.5～2.5之间。

温度与反应速度之间关系，可用Arrhenius方程式来表示：

式中k是反应常数，T为绝对温度，R为气体常数，E为活化能也是常数。在酶反应中V＝K.[E]。所以在酶反应中，LogV和1/T作图为一直线，斜率为－E/2.303R。通过每一直线斜率不难计算出该酶反应的活化能E。

但是，测定酶时都需要酶和底物在一定温度下作用一段时间，在此期间，温度有可能使酶失活，不同酶在此方面差异很大，有些酶如胎盘ALP在56℃放置15分钟，活性也不下降，有些酶如ACP，37℃1小时后，失去50%酶活性。酶的稳定性还与其他因素，如作用时间、pH、有无底物、

图8－22 预温15分钟对ALP活性的影响

有无其它蛋白等有关。同为ALP，在肝提取液中远不如血清中稳定，37℃作用15分钟后肝中此酶活性将显著下降，而血清中几乎没有改变。预温15分钟(37℃,pH9.9)对ALP活性的影响如图8－22所示。又如将血清pH降低到pH6.0以下时,血清中ACP将长期稳定。

目前常规工作实验室越来越多的使用37℃，一些国家已明确推荐使用此温度。这更多地是从实际工作方便来考虑。因为温度升高，反应速度快，灵敏度高。同时延滞时间和测定时间都可能缩短，从而有利于提高工作效率。尤其目前在常规实验室中广泛使用全自动生化分析仪，有高效率的恒温系统，使反应系统很快升温并维持在37℃，可避免温度差异引起的误差，但在37℃时，一些酶可能失活。

早期曾推荐使用25℃为酶测定温度，其优点为接近室温，反应体系温度很容易平衡到此温度，这对于当时使用无有效控温系统的分光光度计来测酶活性有其特别方便之处。但温度低，反应也慢。在有些温热地区，当室温超过25℃时，还需使用降温系统很不方便。因此目前已很少有实验室采用此温度。国际临床化学协会(international federation of clinical chemistry,IFCC)推荐使用的30℃，兼顾了上述二温度的优点。既保证了一定的反应速度，又无酶失活之扰。

37℃和30℃是目前使用最广泛的二种测定酶的使用温度。因此，在比较不同实验室测定结果时，一定要注意由此引起的差异，否则将导致临床诊断的困难和误差。一些作者提出使用温度间的转换系数可使在不同温度测定的结果的比较变为可比，常见酶温度转化系数如表8-15所示。同时，我们从表中也可以看出温度对酶活性测定结果的影响程度。

六、标本采集，处理与贮存对测定结果的影响。

（一）溶血

采取血标本时，抽血不当或急于分离血清等易导致体外溶血，由于大部分酶在细胞内外浓度差异明显，少量血细胞的破坏就可能引起血清中酶明显升高，溶血引起血清中各种物质的变化参见表8-16。