Literature
Home药品天地专业药学实验技术色谱技术色谱入门

生化实验讲义(理论部分)三--层析技术(二)

来源:中国仪器之家
摘要:3离子交换层析3。1简介离子交换层析(IonExchangeChromatography简称为IEC)是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。1848年,Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪40年代,出现了具有稳定交换......

点击显示 收起

3.3 离子交换层析
3.3.1 简介
    离子交换层析(Ion Exchange Chromatography简称为IEC)是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。1848年,Thompson等人在研究土壤碱性物质交换过程中发现离子交换现象。本世纪40年代,出现了具有稳定交换特性的聚苯乙烯离子交换树脂。50年代,离子交换层析进入生物化学领域,应用于氨基酸的分析。目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法,广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。
3.3.2 基本原理
    离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂,它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分:高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合,形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子,它能与溶液中其它的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用,称为阳离子交换剂;平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用,称为阴离子交换剂。离子交换反应可以表示为:
    阳离子交换反应:( R?X? ) Y? + A? ? ( R?X? ) A? + Y?
    阴离子交换反应:( R?X? ) Y? + A? ? ( R?X? ) A? + Y?
    其中R代表离子交换剂的高分子聚合物基质,X? 和X? 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂中与高分子聚合物共价结合的电荷基团,Y? 和Y? 分别代表阳离子交换剂和阴离子交换剂的平衡离子,A? 和A? 分别代表溶液中的离子基团。
    从上面的反应式中可以看出,如果A离子与离子交换剂的结合力强于Y离子,或者提高A离子的浓度,或者通过改变其它一些条件,可以使A离子将Y离子从离子交换剂上置换出来。也就是说,在一定条件下,溶液中的某种离子基团可以把平衡离子置换出来,并通过电荷基团结合到固定相上,而平衡离子则进入流动相,这就是离子交换层析的基本置换反应。通过在不同条件下的多次置换反应,就可以对溶液中不同的离子基团进行分离。下面以阴离子交换剂为例简单介绍离子交换层析的基本分离过程。
    阴离子交换剂的电荷基团带正电,装柱平衡后,与缓冲溶液中的带负电的平衡离子结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。加样后,负电基团可以与平衡离子进行可逆的置换反应,而结合到离子交换剂上。而正电基团和中性基团则不能与离子交换剂结合,随流动相流出而被去除。通过选择合适的洗脱方式和洗脱液,如增加离子强度的梯度洗脱。随着洗脱液离子强度的增加,洗脱液中的离子可以逐步与结合在离子交换剂上的各种负电基团进行交换,而将各种负电基团置换出来,随洗脱液流出。与离子交换剂结合力小的负电基团先被置换出来,而与离子交换剂结合力强的需要较高的离子强度才能被置换出来,这样各种负电基团就会按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下来,从而达到分离目的。
    各种离子与离子交换剂上的电荷基团的结合是由静电力产生的,是一个可逆的过程。结合的强度与很多因素有关,包括离子交换剂的性质、离子本身的性质、离子强度、pH、温度、溶剂组成等等。离子交换层析就是利用各种离子本身与离子交换剂结合力的差异,并通过改变离子强度、pH等条件改变各种离子与离子交换剂的结合力而达到分离的目的。离子交换剂的电荷基团对不同的离子有不同的结合力。一般来讲,离子价数越高,结合力越大;价数相同时,原子序数越高,结合力越大。如阳离子交换剂对离子的结合力顺序为:Li? < Na? < K? < Rb? < Cs? ;Na? < Ca2? < Al3? < Ti4? 。蛋白质等生物大分子通常呈两性,它们与离子交换剂的结合与它们的性质及pH有较大关系。以用阳离子交换剂分离蛋白质为例,在一定的pH条件下,等电点pI < pH的蛋白带负电,不能与阳离子交换剂结合;等电点pI > pH的蛋白带正电,能与阳离子交换剂结合,一般pI越大的蛋白与离子交换剂结合力越强。但由于生物样品的复杂性以及其它因素影响,一般生物大分子与离子交换剂的结合情况较难估计,往往要通过实验进行摸索。
3.3.3 离子交换剂的种类和性质
  1. 离子交换剂的基质
    离子交换剂的大分子聚合物基质可以由多种材料制成,聚苯乙烯离子交换剂(又称为聚苯乙烯树脂)是以苯乙烯和二乙烯苯合成的具有多孔网状结构的聚苯乙烯为基质。聚苯乙烯离子交换剂机械强度大、流速快。但它与水的亲和力较小,具有较强的疏水性,容易引起蛋白的变性。故一般常用于分离小分子物质,如无机离子、氨基酸、核苷酸等。以纤维素(Cellulose)、球状纤维素(Sephacel)、葡聚糖(Sephadex)、琼脂糖(Sepharose)为基质的离子交换剂都与水有较强的亲和力,适合于分离蛋白质等大分子物质,葡聚糖离子交换剂一般以Sephadex G-25和G-50为基质,琼脂糖离子交换剂一般以Sepharose CL-6B为基质。关于这些离子交换剂的性质可以参阅相应的产品介绍。
  2. 离子交换剂的电荷基团
    根据与基质共价结合的电荷基团的性质,可以将离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。
    阳离子交换剂的电荷基团带负电,可以交换阳离子物质。根据电荷基团的解离度不同,又可以分为强酸型、中等酸型和弱酸型三类。它们的区别在于它们电荷基团完全解离的pH范围,强酸型离子交换剂在较大的pH范围内电荷基团完全解离,而弱酸型完全解离的pH范围则较小,如羧甲基在pH小于6时就失去了交换能力。一般结合磺酸基团(?SO3H),如磺酸甲基(简写为SM)、磺酸乙基(SE)等为强酸型离子交换剂,结合磷酸基团(?PO3H2)和亚磷酸基团(?PO2H)为中等酸型离子交换剂,结合酚羟基(?OH )或羧基(?COOH),如羧甲基(CM)为弱酸型离子交换剂。一般来讲强酸型离子交换剂对H离子的结合力比Na+离子小,弱酸型离子交换剂对H离子的结合力比Na+离子大。
    阴离子交换剂的电荷基团带正电,可以交换阴离子物质。同样根据电荷基团的解离度不同,可以分为强碱型、中等碱型和弱碱型三类。一般结合季胺基团(?N(CH3)3),如季胺乙基(QAE)为强碱型离子交换剂,结合叔胺(?N(CH3)2)、仲胺(?NHCH3)、伯胺(-NH2)等为中等或弱碱型离子交换剂,如结合二乙基氨基乙基(DEAE)为弱碱型离子交换剂。一般来讲强碱型离子交换剂对OH?离子的结合力比Cl?离子小,弱酸型离子交换剂对OH?离子的结合力比Cl?离子大。
  3. 交换容量
    交换容量是指离子交换剂能提供交换离子的量,它反映离子交换剂与溶液中离子进行交换的能力。通常所说的离子交换剂的交换容量是指离子交换剂所能提供交换离子的总量,又称为总交换容量,它只和离子交换剂本身的性质有关。在实际实验中关心的是层析柱与样品中各个待分离组分进行交换时的交换容量,它不仅与所用的离子交换剂有关,还与实验条件有很大的关系,一般又称为有效交换容量。后面提到的交换容量如未经说明都是指有效交换容量。
    影响交换容量的因素很多,主要可以分为两个方面,一方面是离子交换剂颗粒大小、颗粒内孔隙大小以及所分离的样品组分的大小等的影响。这些因素主要影响离子交换剂中能与样品组分进行作用的有效表面积。样品组分与离子交换剂作用的表面积越大当然交换容量越高。一般离子交换剂的孔隙应尽量能够让样品组分进入,这样样品组分与离子交换剂作用面积大。分离小分子样品,可以选择较小孔隙的交换剂,因为小分子可以自由的进入孔隙,而小孔隙离子交换剂的表面积大于大孔隙的离子交换剂。对于较大分子样品,可以选择小颗粒交换剂,因为对于很大的分子,一般不能进入孔隙内部,交换只限于颗粒表面,而小颗粒的离子交换剂表面积大。
    另一些影响因素如实验中的离子强度、pH值等主要影响样品中组分和离子交换剂的带电性质。一般pH对弱酸和弱碱型离子交换剂影响较大,如对于弱酸型离子交换剂在pH较高时,电荷基团充分解离,交换容量大,而在较低的pH时,电荷基团不易解离,交换容量小。同时pH也影响样品组分的带电性。尤其对于蛋白质等两性物质,在离子交换层析中要选择合适的pH以使样品组分能充分的与离子交换剂交换、结合。一般来说,离子强度增大,交换容量下降。实验中增大离子强度进行洗脱,就是要降低交换容量以将结合在离子交换剂上的样品组分洗脱下来。
    离子交换剂的总交换容量通常以每毫克或每毫升交换剂含有可解离基团的毫克当量数(meq / mg或meq / ml)来表示。通常可以由滴定法测定。阳离子交换剂首先用HCl处理,使其平衡离子为H?。再用水洗至中性,对于强酸型离子交换剂,用NaCl充分置换出H?,再用标准浓度的NaOH滴定生成的HCl,就可以计算出离子交换剂的交换容量;对于弱酸型离子交换剂,用一定量的碱将H?充分置换出来,再用酸滴定,计算出离子交换剂消耗的碱量,就可以算出交换容量。阴离子交换剂的交换容量也可以用类似的方法测定。
    对于一些常用于蛋白质分离的离子交换剂也通常用每毫克或每毫升交换剂能够吸附某种蛋白质的量来表示,一般这种表示方法对于分离蛋白质等生物大分子具有更大的参考价值。实验前可以参阅相应的产品介绍了解各种离子交换剂的交换容量。
3.3.4 离子交换剂的选择、处理和保存
  1. 离子交换剂的选择
    离子交换剂的种类很多,离子交换层析要取得较好的效果首先要选择合适的离子交换剂。
  首先是对离子交换剂电荷基团的选择,确定是选择阳离子交换剂还是选择阴离子交换剂。这要取决于被分离的物质在其稳定的pH下所带的电荷,如果带正电,则选择阳离子交换剂;如带负电,则选择阴离子交换剂。例如待分离的蛋白等电点为4,稳定的pH范围为6-9,由于这时蛋白带负电,故应选择阴离子交换剂进行分离。强酸或强碱型离子交换剂适用的pH范围广,常用于分离一些小分子物质或在极端pH下的分离。由于弱酸型或弱碱型离子交换剂不易使蛋白质失活,故一般分离蛋白质等大分子物质常用弱酸型或弱碱型离子交换剂。
    其次是对离子交换剂基质的选择。前面已经介绍了,聚苯乙烯离子交换剂等疏水性较强的离子交换剂一般常用于分离小分子物质,如无机离子、氨基酸、核苷酸等。而纤维素、葡聚糖、琼脂糖等离子交换剂亲水性较强,适合于分离蛋白质等大分子物质。一般纤维素离子交换剂价格较低,但分辨率和稳定性都较低,适于初步分离和大量制备。葡聚糖离子交换剂的分辨率和价格适中,但受外界影响较大,体积可能随离子强度和pH变化有较大改变,影响分辨率。琼脂糖离子交换剂机械稳定性较好,分辨率也较高,但价格较贵。
    另外离子交换剂颗粒大小也会影响分离的效果。离子交换剂颗粒一般呈球形,颗粒的大小通常以目数(mesh)或者颗粒直径(?m)来表示,目数越大表示直径越小。前面在介绍交换容量时提到了一些关于交换剂颗粒大小、孔隙的选择。另外离子交换层析柱的分辨率和流速也都与所用的离子交换剂颗粒大小有关。一般来说颗粒小,分辨率高,但平衡离子的平衡时间长,流速慢;颗粒大则相反。所以大颗粒的离子交换剂适合于对分辨率要求不高的大规模制备性分离,而小颗粒的离子交换剂适于需要高分辨率的分析或分离。
    这里特别要提到的是,离子交换纤维素目前种类很多,其中以DEAE-纤维素(二乙基氨基纤维素)和CM-纤维素(羧甲基纤维素)最常用,它们在生物大分子物质(蛋白质,酶,核酸等)的分离方面显示很大的优越性。一是它具有开放性长链和松散的网状结构,有较大的表面积,大分子可自由通过,使它的实际交换容量要比离子交换树脂大的多;二是它具有亲水性,对蛋白质等生物大分子物质吸附的不太牢,用较温和的洗脱条件就可达到分离的目的,因此不致引起生物大分子物质的变性和失活。三是它的回收率高。所以离子交换纤维素已成为非常重要的一类离子交换剂。
  2. 离子交换剂的处理和保存
    离子交换剂使用前一般要进行处理。干粉状的离子交换剂首先要进行膨化,将干粉在水中充分溶胀,以使离子交换剂颗粒的孔隙增大,具有交换活性的电荷基团充分暴露出来。而后用水悬浮去除杂质和细小颗粒。再用酸碱分别浸泡,每一种试剂处理后要用水洗至中性,再用另一种试剂处理,最后再用水洗至中性,这是为了进一步去除杂质,并使离子交换剂带上需要的平衡离子。市售的离子交换剂中通常阳离子交换剂为Na型(即平衡离子是Na离子),阴离子交换剂为Cl型,因为通常这样比较稳定。处理时一般阳离子交换剂最后用碱处理,阴离子交换剂最后用酸处理。常用的酸是HCl,碱是NaOH或再加一定的NaCl,这样处理后阳离子交换剂为Na型,阴离子交换剂为Cl型。使用的酸碱浓度一般小于0.5 mol / L,浸泡时间一般30 min。处理时应注意酸碱浓度不宜过高、处理时间不宜过长、温度不宜过高,以免离子交换剂被破坏。另外要注意的是离子交换剂使用前要排除气泡,否则会影响分离效果。
    离子交换剂的再生是指对使用过的离子交换剂进行处理,使其恢复原来性状的过程。前面介绍的酸碱交替浸泡的处理方法就可以使离子交换剂再生。离子交换剂的转型是指离子交换剂由一种平衡离子转为另一种平衡离子的过程。如对阴离子交换剂用HCl处理可将其转为Cl型,用NaOH处理可转为OH型,用甲酸钠处理可转为甲酸型等等。对离子交换剂的处理、再生和转型的目的是一致的,都是为了使离子交换剂带上所需的平衡离子。
    前面已经介绍了,离子交换层析就是通过离子交换剂上的平衡离子与样品中的组分离子进行可逆的交换而实现分离的目的,因此在离子交换层析前要注意使离子交换剂带上合适的平衡离子,使平衡离子能与样品中的组分离子进行有效的交换。如果平衡离子与离子交换剂结合力过强,会造成组分离子难以与交换剂结合而使交换容量降低。另外还要保证平衡离子不对样品组分有明显影响。因为在分离过程中,平衡离子被置换到流动相中,它不能对样品组分有污染或破坏。如在制备过程中用到的离子交换剂的平衡离子是H或OH离子,因为其它离子都会对纯水有污染。但是在分离蛋白质时,一般不能使用H或OH型离子交换剂,因为分离过程中H或OH离子被置换出来都会改变层析柱内pH值,影响分离效果,甚至引起蛋白质的变性。
    离子交换剂保存时应首先处理洗净蛋白等杂质,并加入适当的防腐剂,一般加入0.02 %的叠氮钠,4?C下保存。
3.3.5 离子交换层析的基本操作
    离子交换层析的基本装置及操作步骤与前面介绍的柱层析类似,这里就不再重复了。下面主要介绍离子交换层析操作中应注意的一些具体问题。
  1. 层析柱
    离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱,离子交换用的层析柱一般粗而短,不宜过长。直径和柱长比一般为1:10到1:50之间,层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整,不能有气泡。
  2. 平衡缓冲液
    离子交换层析的基本反应过程就是离子交换剂平衡离子与待分离物质、缓冲液中离子间的交换,所以在离子交换层析中平衡缓冲液和洗脱缓冲液的离子强度和pH的选择对于分离效果有很大的影响。
    平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。平衡缓冲液的离子强度和pH的选择首先要保证各个待分离物质如蛋白质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合,并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。在一些情况下(如污水处理)可以使杂质与离子交换剂有牢固的结合,而样品与离子交换剂结合不稳定,也可以达到分离的目的。另外注意平衡缓冲液中不能有与离子交换剂结合力强的离子,否则会大大降低交换容量,影响分离效果。选择合适的平衡缓冲液,直接就可以去除大量的杂质。并使得后面的洗脱有很好的效果。如果平衡缓冲液选择不合适,可能会对后面的洗脱带来困难,无法得到好的分离效果。
  3. 上样
    离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强度和pH值,上样量也不宜过大,一般为柱床体积的1-5%为宜,以使样品能吸附在层析柱的上层,得到较好的分离效果。
  4. 洗脱缓冲液
    在离子交换层析中一般常用梯度洗脱,通常有改变离子强度和改变pH两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度,从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来;而改变pH的洗脱,对于阳离子交换剂一般是pH从低到高洗脱,阴离子交换剂一般是pH从高到低。由于pH可能对蛋白的稳定性有较大的影响,故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱。梯度洗脱的装置前面已经介绍了,可以有线性梯度、凹形梯度、凸形梯度以及分级梯度等洗脱方式。一般线性梯度洗脱分离效果较好,故通常采用线性梯度进行洗脱。
    洗脱液的选择首先也是要保证在整个洗脱液梯度范围内,所有待分离组分都是稳定的。其次是要使结合在离子交换剂上的所有待分离组分在洗脱液梯度范围内都能够被洗脱下来。另外可以使梯度范围尽量小一些,以提高分辨率。
  5. 洗脱速度
    洗脱液的流速也会影响离子交换层析分离效果,洗脱速度通常要保持恒定。一般来说洗脱速度慢比快的分辨率要好,但洗脱速度过慢会造成分离时间长、样品扩散、谱峰变宽、分辨率降低等副作用,所以要根据实际情况选择合适的洗脱速度。如果洗脱峰相对集中某个区域造成重叠,则应适当缩小梯度范围或降低洗脱速度来提高分辨率;如果分辨率较好,但洗脱峰过宽,则可适当提高洗脱速度。
  6. 样品的浓缩、脱盐
    离子交换层析得到的样品往往盐浓度较高,而且体积较大,样品浓度较低。所以一般离子交换层析得到的样品要进行浓缩、脱盐处理。
3.3.6 离子交换层析的应用
    离子交换层析的应用范围很广,主要有以下几个方面。
  1. 水处理
    离子交换层析是一种简单而有效的去除水中的杂质及各种离子的方法,聚苯乙烯树脂广泛的应用于高纯水的制备、硬水软化以及污水处理等方面。纯水的制备可以用蒸馏的方法,但要消耗大量的能源,而且制备量小、速度慢,也得不到高纯度。用离子交换层析方法可以大量、快速制备高纯水。一般是将水依次通过H? 型强阳离子交换剂,去除各种阳离子及与阳离子交换剂吸附的杂质;再通过OH? 型强阴离子交换剂,去除各种阴离子及与阴离子交换剂吸附的杂质,即可得到纯水。再通过弱型阳离子和阴离子交换剂进一步纯化,就可以得到纯度较高的纯水。离子交换剂使用一段时间后可以通过再生处理重复使用。
  2. 分离纯化小分子物质
    离子交换层析也广泛的应用于无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离纯化。例如对氨基酸的分析,使用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂,将氨基酸混合液在pH 2~3上柱。这时氨基酸都结合在树脂上,再逐步提高洗脱液的的离子强度和pH,这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来,可以进行分离鉴定。目前已有全部自动的氨基酸分析仪。
  3. 分离纯化生物大分子物质
    离子交换层析是依据物质的带电性质的不同来进行分离纯化的,是分离纯化蛋白质等生物大分子的一种重要手段。由于生物样品中蛋白的复杂性,一般很难只经过一次离子交换层析就达到高纯度,往往要与其它分离方法配合使用。使用离子交换层析分离样品要充分利用其按带电性质来分离的特性,只要选择合适的条件,通过离子交换层析可以得到较满意的分离效果。

3.4 亲和层析
3.4.1 简介
    亲和层析(Affinity Chromatography)是利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种层析技术。人们很早就认识到蛋白质、酶等生物大分子物质能和某些相对应的分子专一而可逆的结合,可以用于对生物分子的分离纯化。但由于技术上的限制,主要是没有合适的固定配体的方法,所以在实验中没有广泛的应用。直到60年代末,溴化氰活化多糖凝胶并偶联蛋白质技术的出现,解决了配体固定化的问题,使得亲和层析技术得到了快速的发展。亲和层析是分离纯化蛋白质、酶等生物大分子最为特异而有效的层析技术,分离过程简单、快速,具有很高的分辨率,在生物分离中有广泛的应用。同时它也可以用于某些生物大分子结构和功能的研究。
3.4.2 亲和层析的基本原理
    生物分子间存在很多特异性的相互作用,如我们熟悉的抗原-抗体、酶-底物或抑制剂、激素-受体等等,它们之间都能够专一而可逆的结合,这种结合力就称为亲和力。亲和层析的分离原理简单的说就是通过将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质上,利用分子间亲和力的特异性和可逆性,对另一个分子进行分离纯化。被固定在基质上的分子称为配体,配体和基质是共价结合的,构成亲和层析的固定相,称为亲和吸附剂。亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲和力物质作为配体,例如分离酶可以选择其底物类似物或竞争性抑制剂为配体,分离抗体可以选择抗原作为配体等等。并将配体共价结合在适当的不溶性基质上,如常用的Sepharose-4B等。将制备的亲和吸附剂装柱平衡,当样品溶液通过亲和层析柱的时候,待分离的生物分子就与配体发生特异性的结合,从而留在固定相上;而其它杂质不能与配体结合,仍在流动相中,并随洗脱液流出,这样层析柱中就只有待分离的生物分子。通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来,就得到了纯化的待分离物质。
    前面介绍的一些层析方法,如吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等都是利用各种分子间的理化特性的差异,如分子的吸附性质、分子大小、分子的带电性质等等进行分离。由于很多生物大分子之间的这种差异较小,所以这些方法的分辨率往往不高。要分离纯化一种物质通常需要多种方法结合使用,这不仅使分离需要较多的操作步骤、较长的时间,而且使待分离物的回收率降低,也会影响待分离物质的活性。亲和层析是利用生物分子所具有的特异的生物学性质-亲和力来进行分离纯化的。由于亲和力具有高度的专一性,使得亲和层析的分辨率很高,是分离生物大分子的一种理想的层析方法。
3.4.3 亲和吸附剂
    选择并制备合适的亲和吸附剂是亲和层析的关键步骤之一。它包括基质和配体的选择、基质的活化、配体与基质的偶联等等。这里主要介绍一些基本的原理,关于活化、偶联等过程的具体实验操作可以参阅本书后面的实验部分或相应的参考书。
  1. 基质
  ⑴ 基质的性质
    基质构成固定相的骨架,亲和层析的基质应该具有以下一些性质:
    1) 具有较好的物理化学稳定性。在与配体偶联、层析过程中配体与待分离物结合、以及洗脱时的pH、离子强度等条件下,基质的性质都没有明显的改变。
    2) 能够和配体稳定的结合。亲和层析的基质应具有较多的化学活性基团,通过一定的化学处理能够与配体稳定的共价结合,并且结合后不改变基质和配体的基本性质。
    3) 基质的结构应是均匀的多孔网状结构。以使被分离的生物分子能够均匀、稳定的通透,并充分与配体结合。基质的孔径过小会增加基质的排阻效应,使被分离物与配体结合的机率下降,降低亲和层析的吸附容量。所以一般来说,多选择较大孔径的基质,以使待分离物有充分的空间与配体结合。
    4) 基质本身与样品中的各个组分均没有明显的非特异性吸附,不影响配体与待分离物的结合。基质应具有较好的亲水性,以使生物分子易于靠近并与配体作用。
    一般纤维素以及交联葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺、多孔玻璃珠等用于凝胶排阻层析的凝胶都可以作为亲和层析的基质,其中以琼脂糖凝胶应用最为广泛。纤维素价格低,可利用的活性基团较多,但它对蛋白质等生物分子可能有明显的非特异性吸附作用,另外它的稳定性和均一性也较差。交联葡聚糖和聚丙烯酰胺的物理化学稳定性较好,但它们的孔径相对比较小,而且孔径的稳定性不好,可能会在与配体偶联时有较大的降低,不利待分离物与配体充分结合,只有大孔径型号凝胶可以用于亲和层析。多孔玻璃珠的特点是机械强度好,化学稳定性好。但它可利用的活性基团较少,对蛋白质等生物分子也有较强的吸附作用。琼脂糖凝胶则基本可以较好的满足上述四个条件,它具有非特异性吸附低、稳定性好、孔径均匀适当、宜于活化等优点,因此得到了广泛的应用,如Pharmacia公司的Sepharose-4B、6B是目前应用较多的基质。
    ⑵ 基质的活化
    基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理,使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。配体和基质的偶联,通常首先要进行基质的活化。
    1) 多糖基质的活化
    前面已经介绍了,多糖基质尤其是琼脂糖是一种常用的基质。琼脂糖通常含有大量的羟基,通过一定的处理可以引入各种适宜的活性基团。琼脂糖的活化方法很多,下面介绍一些常用的活性基团及活化方法。
    ① 溴化氰活化
    溴化氰活化法是最常用的活化方法之一,活化过程主要是生成亚胺碳酸活性基团,它可以和伯氨基(NH2)反应,主要生成异脲衍生物。
    溴化氰活化的基质可以在温和的条件下与配体结合,结合的配体量大。利用溴化氰活化的基质通过进一步处理还可以得到很多其它的衍生物。这种方法的缺点是溴化氰活化法的基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的pKa=10.4,所以通常会带一定的正电荷,从而使基质可能有阴离子离子交换作用,增大了非特异性吸附,影响亲和层析的分辨率。另外溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定,尤其是当与小配体结合时,可能会出现配体脱落现象。另外溴化氰有剧毒、易挥发,所以操作不便。通过实验条件的不断改进,这些缺点可以得到一定程度的控制。
    ②环氧乙烷基活化
    这类方法活化后的基质都含有环氧乙烷基。如在含有NaBH4的碱性条件下,1,4-丁二醇-双缩水甘油醚的一个环氧乙烷基可以与羟基反应,而将另一个环氧乙烷基结合在基质上。另外也可以用环氧氯丙烷活化,将环氧乙烷基结合在基质上。
    这种活化方法的优点是活化后不引入电荷基团,而且基质与配体形成的N-C、O-C和S-C键都很稳定,所以配体与基质结合紧密,亲和吸附剂使用寿命长,而且便于在亲和层析中使用较强烈的洗脱手段,另外这种处理方法没有溴化氰的毒性。它的缺点是用环氧乙基活化的基质在与配体偶联时需要碱性条件,pH为9~13,温度为
20~40 ?C。这样的条件对于一些比较敏感的配体可能不适用。
  上面两种方法是比较常用的方法,另外还有很多种活化方法如:N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化、三嗪(triazine)活化、高碘酸盐(periodate)活化、羰酰二咪唑(carbonyldiimidazole)活化、2,4,6-三氟5-氯吡啶(FCP)活化、乙二酸酰肼(adipic acid dihydrazide)活化、二乙烯砜(divinylsulfone)活化等,总之,目前对基质的活化方法很多,各有其特点,应根据实际需要选择适当的活化方法。
  2) 聚丙烯酰胺的活化
  聚丙烯酰胺凝胶有大量的甲酰胺基,可以通过对甲酰胺基的修饰而对聚丙烯酰胺凝胶进行活化。一般有以下三种方式:氨乙基化作用、肼解作用和碱解作用。另外在偶联蛋白质配体时也通常用戊二醛活化聚丙烯酰胺凝胶。
  3) 多孔玻璃珠的活化
    对于多孔玻璃珠等无机凝胶的活化通常采用硅烷化试剂与玻璃反应生成烷基胺-玻璃,在多孔玻璃上引进氨基,再通过这些氨基进一步反应引入活性基团,与适当的配体偶联。
    ⑶间隔臂分子
    在亲和层析中,由于配体结合在基质上,它在与待分离的生物大分子结合时,很大程度上要受到基质和待分离的生物大分子间的空间位阻效应的影响。尤其是当配体较小或待分离的生物大分子较大时,由于直接结合在基质上的小分子配体非常靠近基质,而待分离的生物大分子由于受到基质的空间障碍,使得其与配体结合的部位无法接近配体,影响了待分离的生物大分子与配体的结合,造成吸附量的降低。解决这一问题的方法通常是在配体和基质之间引入适当长度的“间隔臂”,即加入一段有机分子,使基质上的配体离开基质的骨架向外扩展伸长,这样就可以减少空间位阻效应,大大增加配体对待分离的生物大分子的吸附效率。加入手臂的长度要恰当,太短则效果不明显;太长则容易造成弯曲,反而降低吸附效率。
    引入间隔臂分子常用的方法是将适当长度的氨基化合物NH2 (CH2)n R共价结合到活化的基质上,R通常是氨基或羧基,n一般为2-12。例如Pharmacia公司生产的AH-Sepharose 4B和CH-Sepharose 4B就是分别将1,6-乙二胺,6-氨基乙酸与CNBr活化的琼脂糖反应引入间隔臂分子。二者的末端分别为氨基或羧基,通过碳二亚胺的缩合作用可以分别与含羧基或氨基的配体偶联。
    另外也可以通过进一步的活化处理,生成N-羟基琥珀酰亚胺酯、环氧基等活性基团直接与各种配体偶联。引入间隔臂的基质与配体结合时,配体就可以离开基质一定的空间,从而可以减少空间位阻效应,易于与待分离物质结合。
  2. 配体
    ⑴ 配体的性质
    亲和层析是利用配体和待分离物质的亲和力而进行分离纯化的,所以选择合适的配体对于亲和层析的分离效果是非常重要的。理想的配体应具有以下一些性质:
    1) 配体与待分离的物质有适当的亲和力。亲和力太弱,待分离物质不易与配体结合,造成亲和层析吸附效率很低。而且吸附洗脱过程中易受非特异性吸附的影响,引起分辨率下降。但如果亲和力太强,待分离物质很难与配体分离,这又会造成洗脱的困难。总之,配体和待分离物质的亲和力过弱或过强都不利于亲和层析的分离。应根据实验要求尽量选择与待分离物质具有适当的亲和力的配体。
    2) 配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性,也就是说配体与待分离物质有适当的亲和力,而与样品中其它组分没有明显的亲和力,对其它组分没有非特异性吸附作用。这是保证亲和层析具有高分辨率的重要因素。
    3) 配体要能够与基质稳定的共价结合,在实验过程中不易脱落,并且配体与基质偶联后,对其结构没有明显改变,尤其是偶联过程不涉及配体中与待分离物质有亲和力的部分,对二者的结合没有明显影响。
    4) 配体自身应具有较好的稳定性,在实验中能够耐受偶联以及洗脱时可能的的较剧烈的条件,可以多次重复使用。
    完全满足上述条件的配体实际上很难找到,在实验中应根据具体的条件来选择尽量满足上述条件的最适宜的配体。
    根据配体对待分离物质的亲和性的不同,可以将其分为两类:特异性配体(specific ligand)和通用性配体(general ligand)。特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和它的抑制剂、激素-受体等,它们结合都具有很高的特异性,用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的重要因素,但寻找特异性配体一般是比较困难的,尤其对于一些性质不很了解的生物大分子,要找到合适的特异性配体通常需要大量的实验。解决这一问题的方法是使用通用性的配体。通用性配体一般是指特异性不是很强,能和某一类的蛋白质等生物大分子结合的配体,如各种凝集素(lectine)可以结合各种糖蛋白,核酸可以结合RNA、结合RNA的蛋白质等。通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特异性配体,但通过选择合适的洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配体还具有结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜等优点,所以在实验中得到了广泛的应用。在后面的亲和层析应用中将详细介绍实验中各种常用的配体。
⑵ 配体与基质的偶联
    除了前面已经介绍了基质的一些活化基团外,通过对活化基质的进一步处理,还可以得到更多种类的活性基团。这些活性基团可以在较温和的条件下与含氨基、羧基醛基、酮基、羟基、硫醇基等多种配体反应,使配体偶联在基质上。另外通过碳二亚胺、戊二醛等双功能试剂的作用也可以使配体与基质偶联。以上这些方法使得几乎任何一种配体都可以找到适当的方法与基质偶联。关于配体和基质偶联的具体实验操作可以参阅本书后面的实验部分或相应的参考文献。
    配体和基质偶联完毕后,必须要反复洗涤,以去除未偶联的配体。另外要用适当的方法封闭基质中未偶联上配体的活性基团,也就是使基质失活,以免影响后面的亲和层析分离。例如对于能结合氨基的活性基团,常用的方法是用2-乙醇胺、氨基乙烷等小分子处理。
    配体与基质偶联后,通常要测定配体的结合量以了解其与基质的偶联情况,同时也可以推断亲和层析过程中对待分离的生物大分子吸附容量。配体结合量通常是用每毫升或每克基质结合的配体的量来表示。测定配体结合量的方法很多,下面简单介绍几种:
1) 差量分析:根据加入配体的总量减去配体与基质偶联后洗涤出来的量即可大致推算出配体的结合量。当配体可以用光谱法准确定量时,这种方法还是相当准确的。
2) 直接光谱测量:对于能够吸收250nm以上波长的配体,可以直接用光谱法测定与基质结合的配体的量。
3) 凝胶溶解:通过适当的方法将凝胶溶解,如75?C下与酸或碱作用,而后直接用光谱法测量。
4) 酸或酶的水解:用酸或酶作用,使得基质释放出配体或配体的裂解物进行分析。
5) 2,4,6-三硝基苯磺酸钠(TNBS)分析:利用TNBS与未结合配体和结合某些配体的基质作用呈现不同的颜色,可以计算出配体结合量
6) 元素分析:如果配体中含有某种特别的元素,通过元素分析就可以确定配体结合量。
7) 放射性分析法:偶联中加入一定量带有同位素的配体,通过放射性分析确定配体结合量,这是一种非常灵敏的方法。
    影响配体结合量的因素很多,包括基质和配体的性质、基质的活化方法及条件、基质和配体偶联反应的条件等等。例如通常溴化氰活化的基质的活性基团比环氧基活化的基质多,配体结合量可能较大。在用溴化氰活化时,增加溴化氰的量及反应的pH,可以增加基质上活化基团的量,从而增大配体结合量。偶联过程中增加配体的量及增大反应的pH,也可以增大配体结合量。实验中通常希望配体结合量较高,但应注意增加配体结合量应根据实际情况,还要考虑到其它因素的影响。因为提高配体的结合量不等价于提高亲和吸附剂的吸附容量,配体结合量只是影响亲和吸附剂吸附容量的一个因素,还有很多因素,如基质、配体以及待分离物质本身的性质,配体在基质的结合情况以及后面要介绍的实验操作条件等都可能对亲和吸附剂的吸附容量产生很大的影响。例如增大配体的结合量通常可以增加吸附容量,但有些增大配体结合量的条件可能会影响配体的结构,降低配体和待分离物质的亲和力,这样反而会降低亲和吸附剂的吸附容量。实际影响亲和吸附剂吸附容量的因素是非常复杂的,各种因素的影响都不是绝对的,要获得较高的吸附容量往往要考虑很多因素,并通过实验摸索来选择合适的条件。
  目前已有多种活化的基质以及偶联各种配体的亲和吸附剂制成商品出售,可以省去基质活化,配体偶联等复杂的步骤。使用方便,效果好,但一般价格昂贵。关于这些产品的具体情况,可参阅本书后面的参考文献或相关的产品介绍。
  3. 亲和吸附剂的再生和保存
    亲和吸附剂的再生就是指使用过的亲和吸附剂,通过适当的方法使去除吸附在其基质和配体(主要是配体)上结合的杂质,使亲和吸附剂恢复亲和吸附能力。一般情况下,使用过的亲和层析柱,用大量的洗脱液或较高浓度的盐溶液洗涤,再用平衡液重新平衡即可再次使用。但在一些情况下,尤其是当待分离样品组分比较复杂的时候,亲和吸附剂可能会产生较严重的不可逆吸附,使亲和吸附剂的吸附效率明显下降。这时需要使用一些比较强烈的处理手段,使用高浓度的盐溶液、尿素等变性剂或加入适当的非专一性蛋白酶。但如果配体是蛋白质等一些易于变性的物质,则应注意处理时不能改变配体的活性。
    亲和吸附剂的保存一般是加入0.01%的叠氮化钠,4?C下保存。也可以加入0.5%的醋酸洗必泰或0.05%的苯甲酸。应注意不要使亲和吸附剂冰冻。
3.4.4 亲和层析的基本操作
    亲和吸附剂选择制备后,亲和层析的其它操作与一般的柱层析基本类似。下面主要介绍亲和层析过程中的一些注意事项。
  1. 上样
    亲和层析纯化生物大分子通常采用柱层析的方法。亲和层析柱一般很短,通常10cm左右。上样时应注意选择适当的条件,包括上样流速、缓冲液种类、pH、离子强度、温度等,以使待分离的物质能够充分结合在亲和吸附剂上。
    一般生物大分子和配体之间达到平衡的速度很慢,所以样品液的浓度不易过高,上样时流速应比较慢,以保证样品和亲和吸附剂有充分的接触时间进行吸附。特别是当配体和待分离的生物大分子的亲和力比较小或样品浓度较高、杂质较多时,可以在上样后停止流动,让样品在层析柱中反应一段时间,或者将上样后流出液进行二次上样,以增加吸附量。样品缓冲液的选择也是要使待分离的生物大分子与配体有较强的亲和力。另外样品缓冲液中一般有一定的的离子强度,以减小基质、配体与样品其它组分之间的非特异性吸附。
    生物分子间的亲和力是受温度影响的,通常亲和力随温度的升高而下降。所以在上样时可以选择适当较低的温度,使待分离的物质与配体有较大的亲和力,能够充分的结合;而在后面的洗脱过程可以选择适当较高的温度,使待分离的物质与配体的亲和力下降,以便于将待分离的物质从配体上洗脱下来。
    上样后用平衡洗脱液洗去未吸附在亲和吸附剂上的杂质。平衡缓冲液的流速可以快一些,但如果待分离物质与配体结合较弱,平衡缓冲液的流速还是较慢为宜。如果存在较强的非特异性吸附,可以用适当较高离子强度的平衡缓冲液进行洗涤,但应注意平衡缓冲液不应对待分离物质与配体的结合有明显影响,以免将待分离物质同时洗下。
  2. 洗脱
    亲和层析的另一个重要的步骤就是要选择合适的条件使待分离物质与配体分开而被洗脱出来。亲和层析的洗脱方法可以分为两种:特异性洗脱和非特异性洗脱。
  ⑴ 特异性洗脱
    特异性洗脱是指利用洗脱液中的物质与待分离物质或与配体的亲和特性而将待分离物质从亲和吸附剂上洗脱下来。
    特异性洗脱也可以分为两种:一种是选择与配体有亲和力的物质进行洗脱,另一种是选择与待分离物质有亲和力的物质进行洗脱。前者在洗脱时,选择一种和配体亲和力较强的物质加入洗脱液,这种物质与待分离物质竞争对配体的结合,在适当的条件下,如这种物质与配体的亲和力强或浓度较大,配体就会基本被这种物质占据,原来与配体结合的待分离物质被取代而脱离配体,从而被洗脱下来。例如用凝集素作为配体分离糖蛋白时,可以用适当的单糖洗脱,单糖与糖蛋白竞争对凝集素的结合,可以将糖蛋白从凝集素上置换下来。后一种方法洗脱时,选择一种与待分离物质有较强亲和力的物质加入洗脱液,这种物质与配体竞争对待分离物质的结合,在在适当的条件下,如这种物质与待分离物质的亲和力强或浓度较大,待分离物质就会基本被这种物质结合而脱离配体,从而被洗脱下来。例如用染料作为配体分离脱氢酶时,可以选择NAD+进行洗脱,NAD+是脱氢酶的辅酶,它与脱氢酶的亲和力要强于染料,所以脱氢酶就会与NAD+结合而从配体上脱离。特异性洗脱方法的优点是特异性强,可以进一步消除非特异性吸附的影响,从而得到较高的分辨率。另外对于待分离物质与配体亲和力很强的情况,使用非特异性洗脱方法需要较强烈的洗脱条件,很可能使蛋白质等生物大分子变性,有时甚至只能使待分离的生物大分子变性才能够洗脱下来,使用特异性洗脱则可以避免这种情况。由于亲和吸附达到平衡比较慢,所以特异性洗脱往往需要较常的时间和较大的洗脱条件,可以通过适当的改变其它条件,如选择亲和力强的物质洗脱、加大洗脱液浓度等等,来缩小洗脱时间和洗脱体积。
  ⑵ 非特异性洗脱
    非特异性洗脱是指通过改变洗脱缓冲液pH、离子强度、温度等条件,降低待分离物质与配体的亲和力而将待分离物质洗脱下来。
    当待分离物质与配体亲和力较小时,一般通过连续大体积平衡缓冲液冲洗,就可以在杂质之后将待分离物质洗脱下来,这种洗脱方式简单、条件温和,不会影响待分离物质的活性。但洗脱体积一般比较大,得到的待分离物质浓度较低。当待分离物质和配体结合较强时,可以通过选择适当的pH、离子强度等条件降低待分离物质与配体的亲和力,具体的条件需要在实验中摸索。可以选择梯度洗脱方式,这样可能将亲和力不同的物质分开。如果希望得到较高浓度的待分离物质,可以选择酸性或碱性洗脱液,或较高的离子强度一次快速洗脱,这样在较小的洗脱体积内就能将待分离物质洗脱出来。但选择洗脱液的pH、离子强度时应注意尽量不影响待分离物质的活性,而且洗脱后应注意中和酸碱,透析去除离子,以免待分离物质丧失活性。对于待分离物质与配体结合非常牢固时,可以使用较强的酸、碱或在洗脱液中加入脲、胍等变性剂使蛋白质等待分离物质变性,而从配体上解离出来。然后再通过适当的方法使待分离物质恢复活性。
3.4.5 亲和层析的应用
    亲和层析的应用主要是生物大分子的分离、纯化。下面简单介绍一些亲和层析技术用于纯化各种生物大分子的情况。
  1. 抗原和抗体
    利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析基质上,就可以从血清中分离其对应的抗体。在蛋白质工程菌发酵液中所需蛋白质的浓度通常较低,用离子交换、凝胶过滤等方法都难于进行分离,而亲和层析则是一种非常有效的方法。将所需蛋白质作为抗原,经动物免疫后制备抗体,将抗体与适当基质偶联形成亲和吸附剂,就可以对发酵液中的所需蛋白质进行分离纯化。抗原、抗体间亲和力一般比较强,其解离常数为10 ?8-10 ?12M,所以洗脱时是比较困难的,通常需要较强烈的洗脱条件。可以采取适当的方法如改变抗原、抗体种类或使用类似物等来降低二者的亲和力,以便于洗脱。
    另外金黄色葡萄球菌蛋白A(Protein A)能够与免疫球蛋白G(Ig G)结合,可以用于分离各种Ig G。
  2. 生物素和亲和素
    生物素(biotion)和亲和素(avidin)之间具有很强而特异的亲和力,可以用于亲和层析。如用亲和素分离含有生物素的蛋白等。生物素和亲和素的亲和力很强,其解离常数为10 ?15M,洗脱通常需要强类的变性条件,可以选择biotion的类似物,如2-iminobiotin、diiminobiotin等降低与avidin的亲和力,这样可以在较温和的条件下将其从avidin上洗脱下来。另外,可以利用生物素和亲和素间的高亲和力,将某种配体固定在基质上。例如将生物素酰化的胰岛素与以亲和素为配体的琼脂糖作用,通过生物素与亲和素的亲和力,胰岛素就被固定在琼脂糖上,可以用于亲和层析分离与胰岛素有亲和力的生物大分子物质。这种非共价的间接结合比直接将胰岛素共价结合与CNBr活化的琼脂糖上更稳定。很多种生物大分子可以用生物素标记试剂(如生物素与NHS生成的酯)作用结合上生物素,并且不改变其生物活性,这使得生物素和亲和素在亲和层析分离中有更广泛的用途。
  3. 维生素、激素和结合转运蛋白
    通常结合蛋白含量很低,如1000升人血浆中只含有20毫克Vit B12结合蛋白,用通常的层析技术难于分离。利用维生素或激素与其结合蛋白具有强而特异的亲和力(解离常数为10 ?7-10 ?16M)而进行亲和层析则可以获得较好的分离效果。由于亲和力较强,所以洗脱时可能需要较强烈的条件,另外可以加入适量的配体进行特异性洗脱。
  4. 激素和受体蛋白
    激素的受体蛋白属于膜蛋白,利用去污剂溶解后的膜蛋白往往具有相似的物理性质,难于用通常的层析技术分离。但去污剂溶解通常不影响受体蛋白与其对应激素的结合。所以利用激素和受体蛋白间的高亲和力(10 ?6-10 ?12M)而进行亲和层析是分离受体蛋白的重要方法。目前已经用亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋白,如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、胰岛素等等多种激素的受体。
  5. 凝集素和糖蛋白
    凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白,几乎都是从植物中提取。它们能识别特殊的糖,因此可以用于分离多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的细胞。用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主要方法。如伴刀豆球蛋白A能结合含?-D-吡喃甘露糖苷或?-D-吡喃葡萄糖苷的糖蛋白,麦胚凝集素可以特异的与N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰神经氨酸结合,可以用于血型糖蛋白A、红细胞膜凝集素受体等的分离。洗脱时只需用相应的单糖或类似物,就可以将待分离的糖蛋白洗脱下来。如洗脱伴刀豆球蛋白A吸附的蛋白可以用?-D-甲基甘露糖苷或?-D-甲基葡萄糖苷洗脱。同样,用适当的糖蛋白或单糖、多糖作为配体也可以分离各种凝集素。
  6. 辅酶
    核苷酸及其许多衍生物、各种维生素等是多种酶的辅酶或辅助因子,利用它们与对应酶的亲和力可以对多种酶类进行分离纯化。例如固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶,包括AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等应用很广泛,可以用于分离各种激酶和脱氢酶。
  7. 多核苷酸和核酸
    利用poly-U作为配体可以用于分离mRNA以及各种poly-U结合蛋白。poly-A可以用于分离各种RNA、RNA聚合酶以及其它poly-A结合蛋白。以DNA作为配体可以用于分离各种DNA结合蛋白、DNA聚合酶、RNA聚合酶、核酸外切酶等多种酶类。
  8. 氨基酸
    固定化氨基酸是多用途的介质,通过氨基酸与其互补蛋白间的亲和力,或者通过氨基酸的疏水性等性质,可以用于多种蛋白质、酶的分离纯化。例如L-精氨酸可以用于分离羧肽酶,L-赖氨酸则广泛的应用于分离各种rRNA。
  9. 染料配体
    结合在蓝色葡聚糖中的蓝色染料Cibacron Blue F3GA是一种多芳香环的磺化物。由于它具有与NAD+相似的空间结构,所以它与各种激酶、脱氢酶、血清清蛋白、DNA聚合酶等具有亲和力,可以用于亲和层析分离。另外较常用的还有Procion Red HE3B等。染料作为配体吸附容量高、可以多次重复使用。但它有一定的阳离子交换作用,使用时应适当提高缓冲液离子强度来减少非特异性吸附。
  10. 分离病毒、细胞
    利用配体与病毒、细胞表面受体的相互作用,亲和层析也可以用于病毒和细胞的分离。利用凝集素、抗原、抗体等作为配体都可以用于细胞的分离。例如各种凝集素可以用于分离红细胞以及各种淋巴细胞,胰岛素可以用于分离脂肪细胞等。由于细胞体积大、非特异性吸附强,所以亲和层析时要注意选择合适的基质。目前已有特别的基质如Pharmacia公司生产的Sepharose 6MB,颗粒大、非特异性吸附小,适合用于细胞亲和层析。
  11. 金属螯合色谱
    金属螯合色谱以及后面介绍的共价色谱、疏水色谱是一些特殊的亲和层析技术。金属螯合色谱通常使用亚氨二乙酸(IDA)等螯合剂,它能与Cu2+、Zn2+、Fe2+等作用,生成带有多个配位基的金属螯合物,可以用于生物分子尤其是对重金属有较强亲和力的蛋白质的分离纯化。例如Cu2+-IDA配体可以用于分离带精氨酸的蛋白质。
  12. 共价色谱
    共价色谱与常规的亲和色谱方法不同之处在于它是利用亲和吸附剂与待分离的蛋白质的共价结合而将其吸附,而后用适当的处理方法将共价键打开而将蛋白释放出来。例如活化的巯基-Sepharose、巯丙基-Sepharose等活化基质可以直接与含巯基的蛋白质通过二硫键共价结合而将其吸附在基质上,通过适当的洗脱液如半胱氨酸,巯基乙醇等还原二硫键即可将蛋白质洗脱下来。共价色谱结合和洗脱条件一般都很温和,可以多次重复使用。
  13. 疏水色谱
    疏水色谱是指利用固定的疏水配体和蛋白质疏水表面区域之间的相互作用而进行分离的。例如用各种烷胺作为配体与基质结合,用于分离糖元磷酸化酶b等。

作者:
医学百科App—中西医基础知识学习工具
  • 相关内容
  • 近期更新
  • 热文榜
  • 医学百科App—健康测试工具